Ireo metabolita immunomodulatory dia singa fototra ao amin'ny tontolo manodidina ny fivontosana (TME), saingy ankoatra ny tranga vitsivitsy, dia mbola tsy fantatra mazava ny mombamomba azy ireo. Eto izahay dia nandinika ireo fivontosana sy sela T avy amin'ny fivontosana sy ny ascites amin'ny marary voan'ny carcinoma serous avo lenta (HGSC) mba hampisehoana ny metabolome amin'ireo fizarana TME samihafa ireo. Ny ascites sy ny sela fivontosana dia manana fahasamihafana lehibe amin'ny metabolite. Raha ampitahaina amin'ny ascites, ny sela T miditra amin'ny fivontosana dia manankarena be amin'ny 1-methylnicotinamide (MNA). Na dia avo aza ny haavon'ny MNA ao amin'ny sela T, ny fanehoana ny nicotinamide N-methyltransferase (anzima izay mandrisika ny famindrana vondrona methyl avy amin'ny S-adenosylmethionine mankany amin'ny nicotinamide) dia voafetra amin'ny fibroblasts sy ny sela fivontosana. Amin'ny lafiny fiasa, ny MNA dia mandrisika ny sela T hamoaka ny cytokine tumor necrosis factor alpha izay mampiroborobo ny fivontosana. Noho izany, ny MNA avy amin'ny TME dia mandray anjara amin'ny fanaraha-maso ny hery fiarovana ny sela T ary maneho ny lasibatra immunotherapy mety ho an'ny fitsaboana ny homamiadan'ny olombelona.
Mety hisy fiantraikany lalina amin'ny hery fiarovana amin'ny fivontosana ny metabolites avy amin'ny fivontosana, ary mihamaro hatrany ny porofo mampiseho fa afaka miasa ho hery lehibe amin'ny fivoaran'ny aretina ihany koa izy ireo (1). Ankoatra ny fiantraikan'i Warburg, dia nanomboka nanazava ny toetry ny metabolisman'ny sela fivontosana sy ny fifandraisany amin'ny toetry ny hery fiarovana ao amin'ny tontolo manodidina ny fivontosana (TME) ny asa vao haingana. Ny fanadihadiana natao tamin'ny modely totozy sy ny sela T olombelona dia naneho fa ny metabolisman'ny glutamine (2), ny metabolisman'ny oksidativa (3) ary ny metabolisman'ny gliokaozy (4) dia afaka miasa tsy miankina amin'ny vondron'ny sela fiarovana isan-karazany. Ny metabolites maromaro amin'ireo lalan-kely ireo dia manakana ny fiasan'ny sela T amin'ny fanoherana ny fivontosana. Voaporofo fa ny fanakanana ny coenzyme tetrahydrobiopterin (BH4) dia mety hanimba ny fihanaky ny sela T, ary ny fitomboan'ny BH4 ao amin'ny vatana dia afaka mampitombo ny valin-kafatra fiarovana amin'ny fivontosana izay ampitain'ny CD4 sy CD8. Ankoatra izany, ny fiantraikan'ny kynurenine amin'ny immunosuppressive dia azo vonjena amin'ny alàlan'ny fitantanana ny BH4 (5). Ao amin'ny glioblastoma mutant isocitrate dehydrogenase (IDH), ny famoahana ny enantiometabolic (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) dia manakana ny fampandehanana, ny fihanaky ny sela T ary ny asan'ny cytolysis (6). Vao haingana, dia naseho fa ny methylglyoxal, vokatra azo avy amin'ny glycolysis, dia vokarin'ny sela suppressor avy amin'ny myeloid, ary ny famindrana ny methylglyoxal amin'ny sela T dia afaka manakana ny asan'ny sela effector T. Amin'ny fitsaboana, ny neutralization ny methylglyoxal dia afaka mandresy ny asan'ny sela suppressor avy amin'ny myeloid (MDSC) ary manatsara ny fitsaboana checkpoint blockade amin'ny modely totozy (7). Ireo fanadihadiana ireo dia manantitrantitra miaraka ny anjara asan'ny metabolites avy amin'ny TME amin'ny fanaraha-maso ny asan'ny sela T sy ny asan'izy ireo.
Efa betsaka ny tatitra momba ny tsy fahatomombanan'ny sela T amin'ny homamiadan'ny ovaire (8). Izany dia vokatry ny toetra metabolika ao amin'ny hypoxia sy ny lalan-dra tsy ara-dalàna ao amin'ny fivontosana (9), izay miteraka fiovan'ny glucose sy tryptophan ho vokatra azo avy amin'izany toy ny asidra laktika sy kynurenine. Ny lactate extracellular be loatra dia mampihena ny famokarana interferon-γ (IFN-γ) ary mitarika ny fiforonan'ny vondrona myelosuppressive (10, 11). Ny fihinanana tryptophan dia manakana mivantana ny fihanaky ny sela T ary manakana ny famantarana ny mpandray sela T (12-14). Na eo aza ireo fandinihana ireo, dia betsaka ny asa manodidina ny metabolisman'ny hery fiarovana no natao tamin'ny kolontsaina sela T in vitro tamin'ny fampiasana media nohatsaraina, na voafetra amin'ny modely totozy homologous in vivo, izay tsy maneho tanteraka ny tsy fitoviana amin'ny homamiadan'ny olombelona sy ny tontolo makro sy micro ara-batana.
Ny toetra mahazatra amin'ny homamiadan'ny ovaire dia ny fiparitahan'ny peritoneal sy ny fisehoan'ny ascites. Ny fiangonan'ny tsiranoka sela ao amin'ny ascites dia mifandray amin'ny aretina mandroso sy ny vinavina ratsy (15). Araka ny tatitra, ity fizarana miavaka ity dia tsy misy oksizenina, manana haavon'ny vascular endothelial growth factor (VEGF) sy indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) avo lenta, ary miditra amin'ny sela T regulatory sy sela myeloid inhibitory (15-18). Ny tontolo metabolika ao amin'ny ascites dia mety tsy hitovy amin'ny an'ny fivontosana mihitsy, ka tsy mazava ny fandaharana indray ny sela T ao amin'ny habaka peritoneal. Ankoatra izany, ny fahasamihafana lehibe sy ny tsy fitoviana eo amin'ny ascites sy ny metabolites misy ao amin'ny tontolo fivontosana dia mety hanakana ny fidirana amin'ny sela fiarovana sy ny asany amin'ny fivontosana, ary ilaina ny fikarohana fanampiny.
Mba hamahana ireo olana ireo, dia namorona fomba fanasarahana sela saro-pady sy chromatography ranoka tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) izahay mba handinihana karazana sela samihafa (anisan'izany ny sela CD4+ sy CD8+ T) ary koa ao anatin'ny sy eo anelanelan'ny fivontosana. Ny metabolites ao aminy dia mivelatra amin'ny sela ao amin'ny ascites sy ny tontolo manodidina ny fivontosana mitovy amin'ny marary. Mampiasa ity fomba ity miaraka amin'ny cytometry mikoriana avo lenta sy ny sequencing RNA sela tokana (scRNA-seq) izahay mba hanomezana sary mazava tsara momba ny toetry ny metabolika amin'ireo mponina fototra ireo. Ity fomba ity dia naneho fitomboana be teo amin'ny haavon'ny 1-methylnicotinamide (MNA) ao amin'ny sela T fivontosana, ary ny fanandramana in vitro dia naneho fa ny fiantraikan'ny MNA immunomodulatory amin'ny asan'ny sela T dia tsy fantatra teo aloha. Amin'ny ankapobeny, ity fomba ity dia mampiseho ny fifandraisana metabolika eo amin'ny fivontosana sy ny sela fiarovana, ary manome fahatakarana miavaka momba ny metabolites mifehy ny fiarovana, izay mety ilaina amin'ny fitsaboana ny homamiadan'ny ovaire mifototra amin'ny sela T.
Nampiasa "high-dimensional flow cytometry" izahay mba handrefesana miaraka ny fidiran'ny gliokaozy [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) sy ny asan'ny mitochondria [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) dia marika mahazatra mifanila izay mampiavaka ny sela fiarovana sy ny isan'ny sela fivontosana (Tabilao S2 sy Sary S1A). Nasehon'ity fanadihadiana ity fa raha ampitahaina amin'ny sela T, ny ascites sy ny sela fivontosana dia manana haavon'ny fidiran'ny gliokaozy ambony kokoa, saingy manana fahasamihafana kely kokoa amin'ny asan'ny mitochondria. Ny salan'isan'ny fidiran'ny gliokaozy amin'ny sela fivontosana [CD45-EpCAM (EpCAM)+] dia intelo ka hatramin'ny inefatra heny noho ny an'ny sela T, ary ny salan'isan'ny fidiran'ny gliokaozy amin'ny sela CD4 + T dia intelo ka hatramin'ny inefatra heny noho ny an'ny sela CD8 + T, izay midika fa ny lymphocytes miditra amin'ny sela (TIL) dia manana fepetra metabolika samihafa na dia ao amin'ny TME iray ihany aza (Sary 1A). Mifanohitra amin'izany, ny fiasan'ny mitochondria ao amin'ny sela fivontosana dia mitovy amin'ny an'ny sela CD4 + T, ary ny fiasan'ny mitochondria amin'ny karazana sela roa dia ambony noho ny an'ny sela CD8 + T (Sary 1B). Amin'ny ankapobeny, ireo valiny ireo dia mampiseho ny haavon'ny metabolisma. Ny fiasan'ny metabolisman'ny sela fivontosana dia ambony noho ny an'ny sela CD4 + T, ary ny fiasan'ny metabolisman'ny sela CD4 + T dia ambony noho ny an'ny sela CD8 + T. Na eo aza ireo fiantraikany ireo amin'ny karazana sela, dia tsy misy fahasamihafana mitovy amin'ny toetry ny metabolisman'ny sela CD4 + sy CD8 + T na ny ampahany amin'izy ireo amin'ny ascites raha oharina amin'ny fivontosana (Sary 1C). Mifanohitra amin'izany, ao amin'ny ampahany amin'ny sela CD45, ny ampahany amin'ny sela EpCAM+ ao amin'ny fivontosana dia nitombo raha oharina amin'ny ascites (Sary 1D). Nahita fahasamihafana metabolika mazava ihany koa izahay teo amin'ny singa sela EpCAM+ sy EpCAM-. Ny sela EpCAM+ (fivontosana) dia manana fidiran'ny glucose sy fiasan'ny mitochondria ambony kokoa noho ny sela EpCAM-, izay ambony lavitra noho ny fiasan'ny metabolisman'ny fibroblasts ao amin'ny sela fivontosana ao amin'ny TME (Sary 1, E sy F).
(A sy B) Haavon'ny fluorescence antonony (MFI) amin'ny fidiran'ny gliokaozy (2-NBDG) (A) sy ny asan'ny mitochondria amin'ny sela CD4 + T (MitoTracker mena maizina) (B) Grafika solontena (ankavia) sy angon-drakitra voasokajy (Ankavanana), sela CD8 + T ary sela EpCAM + CD45-fivontosana avy amin'ny ascites sy ny fivontosana. (C) Ny tahan'ny sela CD4 + sy CD8 + (an'ny sela CD3 + T) ao amin'ny ascites sy ny fivontosana. (D) Ampahan'ny sela EpCAM + fivontosana ao amin'ny ascites sy ny fivontosana (CD45−). (E sy F) Fidiran'ny gliokaozy EpCAM + CD45-fivontosana sy EpCAM-CD45-matrix (2-NBDG) (E) ary ny asan'ny mitochondria (MitoTracker mena maizina) (F) grafika solontena (ankavia) sy angon-drakitra voasokajy (Ankavanana) Ascites sy sela fivontosana. (G) Grafika solontenan'ny fanehoana CD25, CD137 ary PD1 amin'ny alàlan'ny cytometry mikoriana. (H sy I) Fisehoan'ny CD25, CD137 ary PD1 amin'ny sela CD4 + T (H) sy CD8 + T (I). (J sy K) Endriky ny fahatsiarovana afovoany (Tcm), ny effector (Teff) ary ny effector memory (Tem) mifototra amin'ny fanehoan'ny CCR7 sy CD45RO. Sary maneho (ankavia) sy angon-drakitra tabilao (ankavanana) an'ny sela CD4 + T (J) sy CD8 + T (K) amin'ny ascites sy fivontosana. Ny sandan'ny P dia voafaritra amin'ny alàlan'ny t-test mifanandrify (*P<0.05, **P<0.01 ary ***P<0.001). Ny tsipika dia maneho ireo marary mifanaraka (n = 6). FMO, fluorescence miiba iray; MFI, hamafin'ny fluorescence antonony.
Ny fanadihadiana fanampiny dia naneho fahasamihafana manan-danja hafa teo amin'ny toetry ny phenotype sela T tena voafaritra tsara. Ny fahatsiarovana mavitrika (Sary 1, G hatramin'ny I) sy ny fahatsiarovana effector (Sary 1, J sy K) ao amin'ny fivontosana dia matetika kokoa noho ny ascites (isan-jaton'ny sela CD3 + T). Toy izany koa, ny famakafakana ny phenotype amin'ny alàlan'ny fanehoana ny mari-pamantarana activation (CD25 sy CD137) sy ny mari-pamantarana depletion [programmed cell death protein 1 (PD1)] dia naneho fa na dia samy hafa aza ny toetran'ny metabolika amin'ireo mponina ireo (Sary S1, B hatramin'ny E), dia tsy nisy fahasamihafana manan-danja teo amin'ny metabolika teo amin'ny subsets naive, effector na memory (Sary S1, F hatramin'ny I). Ireo valiny ireo dia nohamafisina tamin'ny fampiasana fomba fianarana milina mba hanendrena ho azy ny phenotype sela (21), izay naneho bebe kokoa ny fisian'ny sela tsoka taolana maro (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) ao amin'ny ascites an'ny marary (Sary S2A). Anisan'ireo karazana sela rehetra voafaritra, ity vondron'ny sela myeloid ity no naneho ny fandraisana gliokaozy sy ny fiasan'ny mitochondria avo indrindra (Sary S2, B hatramin'ny G). Ireo valiny ireo dia manasongadina ny fahasamihafana goavana eo amin'ny metabolisma eo amin'ny karazana sela maro hita amin'ny ascites sy ny fivontosana amin'ny marary HGSC.
Ny fanamby lehibe amin'ny fahatakarana ny toetran'ny metabonômika an'ny TIL dia ny filàna manasaraka santionan'ny sela T manana fahadiovana, kalitao ary habetsahana ampy avy amin'ny fivontosana. Ny fanadihadiana vao haingana dia naneho fa ny fomba fanasokajiana sy fanatsarana ny vakana mifototra amin'ny cytometry mikoriana dia mety hitarika fiovana eo amin'ny mombamomba ny metabolite sela (22-24). Mba handresena io olana io, dia nohatsarainay ny fomba fanatsarana ny vakana mba hanavahana sy hanavahana ny TIL amin'ny homamiadan'ny ovaire olombelona nodidiana alohan'ny famakafakana amin'ny alàlan'ny LC-MS/MS (jereo ny Fitaovana sy Fomba; Sary 2A). Mba hanombanana ny fiantraikan'ity protocole ity amin'ny fiovan'ny metabolite, dia nampitahainay ny mombamomba ny metabolite an'ny sela T izay nohetsehin'ny mpanome salama taorian'ny dingana fisarahana vakana etsy ambony tamin'ny sela izay tsy nosarahina vakana fa nijanona teo ambony ranomandry. Ity fanadihadiana fanaraha-maso ny kalitao ity dia nahita fa misy fifandraisana avo lenta eo amin'ireo toe-javatra roa ireo (r = 0.77), ary ny famerimberenana ara-teknika ny vondrona metabolite 86 dia manana famerimberenana avo lenta (Sary 2B). Noho izany, ireo fomba ireo dia afaka manao fanadihadiana metabolite marina ao anatin'ny sela izay anaovana fanatsarana ny karazana sela, ka manome sehatra avo lenta voalohany hamantarana ireo metabolites manokana ao amin'ny HGSC, izay ahafahan'ny olona mahazo fahatakarana lalindalina kokoa momba ny fandaharan'asa metabolisma ara-pananahana manokana.
(A) Kisarisary skematika momba ny fanatsarana ny vakana magnetika. Alohan'ny hanaovana fanadihadiana amin'ny alalan'ny LC-MS/MS, dia handalo dingana telo mifanesy amin'ny fanatsarana ny vakana magnetika ireo sela na hijanona eo ambony ranomandry. (B) Ny fiantraikan'ny karazana fanatsarana amin'ny habetsahan'ny metabolites. Ny salan'isa amin'ny fandrefesana telo ho an'ny karazana fanatsarana tsirairay ± SE. Ny tsipika volondavenona dia maneho fifandraisana 1:1. Ny fifandraisana intra-class (ICC) amin'ny fandrefesana miverimberina aseho amin'ny marika axis. NAD, nicotinamide adenine dinucleotide. (C) Kisarisary skematika momba ny fizotran'ny fanadihadiana ny metabolite ho an'ny marary. Angonina avy amin'ny marary ny ascites na ny fivontosana ary cryopreserved. Ampahany kely amin'ny santionany tsirairay no nohadihadiana tamin'ny alalan'ny flow cytometry, raha ny santionany sisa kosa dia nandalo dingana telo fanatsarana ho an'ny sela CD4+, CD8+ ary CD45-. Ireo ampahany amin'ny sela ireo dia nohadihadiana tamin'ny alalan'ny LC-MS/MS. (D) Sarintany hafanana momba ny habetsahan'ny metabolites manara-penitra. Ny dendrogram dia maneho ny fivondronan'i Ward ny elanelana Euclidean eo amin'ny santionany. (E) Famakafakana singa fototra (PCA) amin'ny sarintany metabolite santionany, mampiseho famerenana telo amin'ny santionany tsirairay, ny santionany avy amin'ny marary iray ihany dia ampifandraisina amin'ny tsipika. (F) Ny PCA amin'ny mombamomba ny metabolite an'ny santionany mifototra amin'ny marary (izany hoe, mampiasa famerimberenana ampahany); ny karazana santionany dia voafetra amin'ny vatan-kazo mibontsina. PC1, singa fototra 1; PC2, singa fototra 2.
Manaraka izany, nampihatra ity fomba fanatsarana ity izahay mba handinihana ireo metabolita 99 ao amin'ny ampahan'ny sela CD4+, CD8+ ary CD45 ao amin'ny ascites voalohany sy ny fivontosana amin'ny marary HGSC enina (Sary 2C, Sary S3A ary Tabilao S3 sy S4). Ny mponina liana dia mitentina 2% hatramin'ny 70% amin'ny santionany lehibe tany am-boalohany amin'ny sela velona, ​​ary miovaova be ny isan'ny sela eo amin'ny marary. Rehefa avy nanasaraka ireo vakana, ny ampahany manankarena liana (CD4+, CD8+ na CD45-) dia mitentina mihoatra ny 85% amin'ny sela velona rehetra ao amin'ny santionany amin'ny ankapobeny. Ity fomba fanatsarana ity dia ahafahantsika mamakafaka ny isan'ny sela avy amin'ny metabolisman'ny sela fivontosana olombelona, ​​izay tsy azo atao avy amin'ny santionany lehibe. Amin'ny fampiasana ity protocole ity, dia voafaritray fa ny l-kynurenine sy adenosine, ireo metabolita immunosuppressive roa voafaritra tsara ireo dia niakatra tao amin'ny sela T fivontosana na sela fivontosana (Sary S3, B sy C). Noho izany, ireo valiny ireo dia mampiseho ny fahamarinan'ny teknolojia fanasarahana sela sy ny spectrometry faobe mba hahitana metabolites manan-danja ara-biolojika ao amin'ny sela marary.
Ny fanadihadianay koa dia naneho fisarahana metabolika matanjaka eo amin'ny karazana sela ao anatin'ny sy eo amin'ireo marary (Sary 2D sy Sary S4A). Indrindra indrindra, raha ampitahaina amin'ny marary hafa, ny marary 70 dia naneho toetra metabolika samihafa (Sary 2E sy Sary S4B), izay manondro fa mety hisy fahasamihafana metabolika lehibe eo amin'ireo marary. Tsara homarihina fa raha ampitahaina amin'ny marary hafa (1.2 hatramin'ny 2 litatra; Tabilao S1), ny habetsahan'ny ascites rehetra voangona tao amin'ny marary 70 (80 ml) dia kely kokoa. Ny fanaraha-maso ny tsy fitoviana eo amin'ny marary mandritra ny fanadihadiana ny singa fototra (ohatra, amin'ny fampiasana fanadihadiana ny redundancy ampahany) dia mampiseho fiovana tsy tapaka eo amin'ny karazana sela, ary ny karazana sela sy/na ny tontolo iainana bitika dia voangona mazava tsara araka ny mombamomba ny metabolite (Sary 2F). Ny fanadihadiana ny metabolites tokana dia nanantitrantitra ireo fiantraikany ireo ary naneho fahasamihafana lehibe eo amin'ny karazana sela sy ny tontolo iainana bitika. Tsara homarihina fa ny fahasamihafana tafahoatra indrindra hita dia ny MNA, izay matetika manankarena amin'ny sela CD45- sy amin'ny sela CD4+ sy CD8+ izay miditra ao amin'ny fivontosana (Sary 3A). Ho an'ny sela CD4+, ity fiantraikany ity no tena miharihary, ary toa voakasiky ny tontolo iainana mafy ihany koa ny MNA ao amin'ny sela CD8+. Na izany aza, tsy zava-dehibe izany, satria telo amin'ireo marary enina ihany no azo tombanana ny isa CD8+ amin'ny fivontosana. Ankoatra ny MNA, amin'ny karazana sela samihafa amin'ny ascites sy ny fivontosana, ny metabolites hafa izay tsy dia voafaritra tsara ao amin'ny TIL dia samy hafa ihany koa ny harena (Sary S3 sy S4). Noho izany, ireo angon-drakitra ireo dia mampiseho andiana metabolites immunomodulatory mampanantena ho an'ny fikarohana bebe kokoa.
(A) Ny votoatin'ny MNA voarindra ao amin'ny sela CD4+, CD8+ ary CD45- avy amin'ny ascites sy ny fivontosana. Ny kisarisary boaty dia mampiseho ny mediana (tsipika), ny elanelana interquartile (rindrina) ary ny elanelan'ny angona, hatramin'ny in-1.5 amin'ny elanelana interquartile (rindrina). Araka ny voalaza ao amin'ny Materials and Methods ho an'ny Marary, ampiasao ny sandan'ny limma an'ny marary mba hamaritana ny sandan'ny P (*P<0.05 ary **P<0.01). (B) Kisarisary skematika momba ny metabolisman'ny MNA (60). Metabolita: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, nicotinamide ribose; NMN, nicotinamide mononucleotide. Anzima (maitso): NNMT, nicotinamide N-methyltransferase; SIRT, sirtuins; NAMPT, nicotinamide phosphoribosyl transferase; AOX1, aldehyde oxidase 1; NRK, nicotinamide riboside kinase; NMNAT, nicotinamide mono Nucleotide adenylate transferase; Pnp1, purine nucleoside phosphorylase. (C) t-SNE an'ny scRNA-seq an'ny ascites (volondavenona) sy fivontosana (mena; n = marary 3). (D) Fisehoan'ny NNMT amin'ny vondron'ny sela samihafa voafaritra amin'ny alàlan'ny scRNA-seq. (E) Fisehoan'ny NNMT sy AOX1 ao amin'ny SK-OV-3, voa embryonika olombelona (HEK) 293T, sela T ary sela T notsaboina tamin'ny MNA. Aseho ny fisehoan'ny mivalombalona raha oharina amin'ny SK-OV-3. Aseho ny lamina fisehoan'ny SEM (n = mpanome salama 6). Ny sandan'ny Ct mihoatra ny 35 dia heverina ho tsy hita (UD). (F) Fisehoan'ny SLC22A1 sy SLC22A2 ao amin'ny SK-OV-3, HEK293T, sela T ary sela T notsaboina tamin'ny 8mM MNA. Aseho ny fisehoana miforitra raha oharina amin'ny SK-OV-3. Aseho ny lamina fisehoana amin'ny SEM (n = 6 mpanome salama). Ny sandan'ny Ct mihoatra ny 35 dia heverina ho tsy hita (UD). (G) Votoatin'ny MNA amin'ny sela ao amin'ny sela T mpanome salama efa miasa aorian'ny 72 ora nipetrahana tamin'ny MNA. Aseho ny lamina fisehoana amin'ny SEM (n = 4 mpanome salama).
Ny MNA dia vokarina amin'ny famindrana ny vondrona methyl avy amin'ny S-adenosyl-1-methionine (SAM) mankany amin'ny nicotinamide (NA) amin'ny alàlan'ny nicotinamide N-methyltransferase (NNMT; Sary 3B). Ny NNMT dia miseho be loatra amin'ny karazana homamiadana isan-karazany ary mifandray amin'ny fihanaky ny sela, ny fanafihana ary ny metastasis (25-27). Mba hahatakarana bebe kokoa ny loharanon'ny MNA ao amin'ny sela T ao amin'ny TME, dia nampiasa scRNA-seq izahay mba hanazavana ny fanehoana ny NNMT amin'ny karazana sela ao amin'ny ascites sy ny fivontosana amin'ny marary HGSC telo (Tabilao S5). Ny fanadihadiana ny sela eo amin'ny 6.500 eo ho eo dia naneho fa ao amin'ny ascites sy ny tontolo iainana misy fivontosana, ny fanehoana ny NNMT dia voafetra amin'ny vondron'ny sela fibroblast sy fivontosana heverina (Sary 3, C sy D). Tsara homarihina fa tsy misy fanehoana NNMT miharihary amin'ny vondron'olona rehetra izay maneho PTPRC (CD45 +) (Sary 3D sy Sary S5A), izay manondro fa ny MNA hita ao amin'ny spectrum metabolite dia nampidirina tao amin'ny sela T. Ny fanehoan'ny aldehyde oxidase 1 (AOX1) dia manova ny MNA ho 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide (2-PYR) na 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide (4-PYR); Sary 3B) dia voafetra ihany koa amin'ny isan'ny fibroblasts maneho COL1A1 (Sary S5A), izay miaraka manondro fa ny sela T dia tsy manana ny fahafahan'ny metabolisman'ny MNA mahazatra. Ny lamina fanehoan'ireo fototarazo mifandraika amin'ny MNA ireo dia nohamarinina tamin'ny fampiasana angon-drakitra sela mahaleo tena faharoa avy amin'ny ascites avy amin'ny marary HGSC (Sary S5B; n = 6) (16). Ankoatra izany, ny fanadihadiana momba ny polymerase chain reaction (qPCR) an'ny sela T mpanome salama notsaboina tamin'ny MNA dia naneho fa raha ampitahaina amin'ny sela fivontosana ovaire SK-OV-3 fanaraha-maso, dia saika tsy naneho ny NNMT na AOX1 (Sary 3E). Ireo valiny tsy nampoizina ireo dia manondro fa ny MNA dia mety havoaka avy amin'ny fibroblasts na fivontosana ho any amin'ny sela T mifanila amin'ny TME.
Na dia ahitana ny fianakavian'ny mpitatitra cation organika 1 hatramin'ny 3 (OCT1, OCT2 ary OCT3) izay voarakitry ny fianakaviana mpitatitra soluble 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 ary SLC22A3) aza ireo kandidà, dia mbola tsy voafaritra ireo mpitatitra mety ho an'ny MNA (28). Ny QPCR an'ny mRNA avy amin'ny sela T mpanome salama dia naneho ambaratonga ambany amin'ny fanehoana ny SLC22A1 saingy tsy hita ny ambaratongan'ny SLC22A2, izay nanamafy fa efa notaterina tao amin'ny literatiora izany teo aloha (Sary 3F) (29). Mifanohitra amin'izany kosa, ny tsipika sela fivontosan'ny ovaire SK-OV-3 dia naneho ambaratonga avo amin'ireo mpitatitra roa ireo (Sary 3F).
Mba hitsapana ny mety ho fahafahan'ny sela T mandray MNA vahiny, dia novolena nandritra ny 72 ora ireo sela T mpanome salama teo anatrehan'ny fifantohana MNA samihafa. Raha tsy misy MNA avy any ivelany, dia tsy hita ny votoatin'ny MNA ao amin'ny sela (Sary 3G). Na izany aza, ireo sela T miasa izay notsaboina tamin'ny MNA avy any ivelany dia naneho fitomboan'ny votoatin'ny MNA ao amin'ny sela miankina amin'ny fatra, hatramin'ny 6 mM MNA (Sary 3G). Ity valiny ity dia manondro fa na dia ambany aza ny haavon'ny fanehoana mpitatitra sy ny tsy fisian'ny anzima lehibe tompon'andraikitra amin'ny metabolisman'ny MNA ao anaty sela, dia mbola afaka mandray MNA ny TIL.
Ny karazana metabolites ao amin'ny sela T an'ny marary sy ny andrana fidiran'ny MNA in vitro dia mampitombo ny mety hisian'ny fibroblasts mifandraika amin'ny homamiadana (CAF) mamoaka MNA ary ny sela fivontosana dia mety handrindra ny phenotype sy ny fiasan'ny TIL. Mba hamaritana ny fiantraikan'ny MNA amin'ny sela T, dia navitrika in vitro ny sela T mpanome salama na teo aza na tsy teo ny MNA, ary nojerena ny fihanaky ny sela sy ny famokarana cytokine. Rehefa afaka 7 andro nanampiana MNA tamin'ny fatra ambony indrindra, dia nihena antonony ny isan'ny mponina avo roa heny, raha mbola voatazona ny heriny amin'ny fatra rehetra (Sary 4A). Ho fanampin'izany, ny fitsaboana ny MNA exogenous dia nahatonga ny fitomboan'ny isan'ny sela T CD4 + sy CD8 + maneho ny tumor necrosis factor-α (TNFα; Sary 4B). Mifanohitra amin'izany, ny famokarana IFN-γ intracellular dia nihena be tao amin'ny sela T CD4 +, fa tsy tao amin'ny sela T CD8 +, ary tsy nisy fiovana lehibe teo amin'ny interleukin 2 (IL-2; Sary 4, C sy D). Noho izany, ny fanadihadiana momba ny immunosorbent mifandray amin'ny enzyme (ELISA) amin'ny supernatants avy amin'ireo kolontsaina sela T notsaboina tamin'ny MNA dia naneho fitomboana be dia be amin'ny TNFα, fihenan'ny IFN-γ, ary tsy nisy fiovana teo amin'ny IL-2 (Sary 4, E hatramin'ny G). Ny fihenan'ny IFN-γ dia manondro fa ny MNA dia mety mitana anjara toerana amin'ny fanakanana ny asan'ny sela T manohitra ny fivontosana. Mba hanahafana ny fiantraikan'ny MNA amin'ny cytotoxicity ateraky ny sela T, ny sela chimeric antigen receptor T (FRα-CAR-T) mikendry ny folate receptor α sy ny CAR-T (GFP) fehezin'ny sela proteinina fluorescent maitso (GFP) -CAR-T) dia vokarin'ny sela mononuclear ra peripheral salama (PBMC). Ny sela CAR-T dia novolena nandritra ny 24 ora teo anatrehan'ny MNA, ary avy eo dia novolena niaraka tamin'ny sela fivontosana ovaire SK-OV-3 olombelona izay maneho folate receptor α amin'ny tahan'ny effector amin'ny lasibatra 10:1. Nihena be ny asan'ny sela FRα-CAR-T tamin'ny famonoana sela FRα-CAR-T vokatry ny fitsaboana MNA, izay mitovy amin'ny sela FRα-CAR-T notsaboina tamin'ny adenosine (Sary 4H).
(A) Isan'ny sela velona manontolo sy ny fitomboan'ny isan'ny sela (PD) mivantana avy amin'ny kolontsaina tamin'ny andro faha-7. Ny grafika bara dia maneho ny salan'isa + SEM an'ny mpanome salama enina. Maneho angon-drakitra avy amin'ny fanandramana mahaleo tena n = 3 farafahakeliny. (B hatramin'ny D) Ny CD3/CD28 sy IL-2 dia nampiasaina mba hampavitrika ny sela T amin'ny fifantohana MNA tsirairay avy mandritra ny 7 andro. Talohan'ny fanadihadiana, dia nohetsehina tamin'ny PMA/ionomycin niaraka tamin'ny GolgiStop nandritra ny 4 ora ny sela. Fanehoana TNFα (B) ao amin'ny sela T. Sary ohatra (ankavia) sy angon-drakitra tabilao (ankavanana) momba ny fanehoana TNFα ao amin'ny sela velona. Fanehoana IFN-γ (C) sy IL-2 (D) ao amin'ny sela T. Ny fanehoana cytokines dia norefesina tamin'ny alalan'ny cytometry mikoriana. Ny grafika bara dia maneho ny salan'isa (n = mpanome salama 6) + SEM. Ampiasao ny famakafakana tokana momba ny variance sy ny fandrefesana miverimberina (*P<0.05 sy **P<0.01) mba hamaritana ny sandan'ny P. Maneho angon-drakitra avy amin'ny fanandramana mahaleo tena n = 3 farafahakeliny. (E hatramin'ny G) Nampiasaina ny CD3/CD28 sy IL-2 mba hampavitrika ny sela T amin'ny fifantohana MNA tsirairay avy mandritra ny 7 andro. Nangonina ny fitaovana taloha sy taorian'ny 4 ora nanaovana fanentanana PMA/ionomycin. Ny fifantohana TNFα (E), IFN-γ (F) ary IL-2 (G) dia norefesina tamin'ny ELISA. Ny grafika bara dia maneho ny salan'isa (n = 5 mpanome salama) + SEM. Ny sandan'ny P dia voafaritra amin'ny alàlan'ny fanadihadiana tokana momba ny variance sy ny fandrefesana miverimberina (*P<0.05). Ny tsipika teboteboka dia manondro ny fetran'ny fahitana. (H) Fanadihadiana momba ny lysis sela. Ny sela FRα-CAR-T na GFP-CAR-T dia namboarina tamin'ny adenosine (250μM) na MNA (10 mM) nandritra ny 24 ora, na tsy notsaboina (Ctrl). Ny isan-jaton'ny famonoana ny sela SK-OV-3 dia norefesina. Ny sandan'ny P dia voafaritra amin'ny alàlan'ny fitsapana t Welch (*P<0.5 ary **P<0.01).
Mba hahazoana fahatakarana mekanisma momba ny fandrindrana ny fanehoana TNFα miankina amin'ny MNA, dia nojerena ny fiovan'ny TNFα mRNA amin'ny sela T voatsabo MNA (Sary 5A). Ny sela T mpanome salama notsaboina tamin'ny MNA dia naneho fitomboana avo roa heny amin'ny haavon'ny fandikana TNFα, izay manondro fa ny MNA dia miankina amin'ny fandrindrana ny fandikana TNFα. Mba handinihana ity mekanisma fandrindrana ity, dia nojerena ny singa fandikana roa fantatra izay mandrindra ny TNFα, dia ny singa nokleary sela T mavitrika (NFAT) sy ny proteinina manokana 1 (Sp1), ho setrin'ny fifamatoran'ny MNA amin'ny mpandrindra TNFα akaiky (30). Ny mpandrindra TNFα dia misy toerana fifamatoran'ny NFAT 6 voafaritra sy toerana fifamatoran'ny Sp1 2, mifanindry amin'ny toerana iray [-55 tsiroaroa fototra (bp) avy amin'ny 5'cap] (30). Ny immunoprecipitation Chromatin (ChIP) dia naneho fa rehefa notsaboina tamin'ny MNA, dia nitombo avo telo heny ny fifamatoran'ny Sp1 amin'ny mpandrindra TNFα. Nitombo ihany koa ny fampidirana ny NFAT ary nanakaiky ny maha-zava-dehibe azy (Sary 5B). Ireo angon-drakitra ireo dia manondro fa ny MNA dia mandrindra ny fanehoana ny TNFα amin'ny alàlan'ny fandikana Sp1, ary amin'ny ambaratonga kely kokoa dia ny fanehoana ny NFAT.
(A) Raha ampitahaina amin'ny sela T novolena tsy misy MNA, ny fiovan'ny fanehoana TNFα ao amin'ny sela T notsaboina tamin'ny MNA. Aseho ny lamina fanehoana amin'ny SEM (n = 5 mpanome salama). Maneho angon-drakitra avy amin'ny fanandramana mahaleo tena n = 3 farafahakeliny. (B) Ny mpandrindra TNFα an'ny sela T notsaboina tamin'ny na tsy nisy MNA 8 mM taorian'ny NFAT sy Sp1 dia nampiarahina tamin'ny (Ctrl) sy ny fanentanana PMA/ionomycin nandritra ny 4 ora. Ny Immunoglobulin G (IgG) sy H3 dia nampiasaina ho fanaraha-maso ratsy sy tsara ho an'ny immunoprecipitation. Ny fandrefesana ny ChIP dia naneho fa ny fifamatoran'ny Sp1 sy NFAT amin'ny mpandrindra TNFα ao amin'ny sela notsaboina tamin'ny MNA dia nitombo imbetsaka raha oharina amin'ny fanaraha-maso. Maneho angon-drakitra avy amin'ny fanandramana mahaleo tena n = 3 farafahakeliny. Ny sandan'ny P dia voafaritra amin'ny fitsapana-t maromaro (*** P <0.01). (C) Raha ampitahaina amin'ny ascites an'ny HGSC, ny sela T (tsy cytotoxic) dia naneho fitomboan'ny fanehoana TNF ao amin'ny fivontosana. Ny loko dia maneho marary samihafa. Ireo sela naseho dia nosafidiana kisendrasendra hatramin'ny 300 ary nohetsehina mba hampihenana ny fihoaram-pefy (** Padj = 0.0076). (D) Modely naroso ho an'ny homamiadan'ny ovaire. Ny MNA dia vokarina ao amin'ny sela fivontosana sy fibroblasts ao amin'ny TME ary raisin'ny sela T. Ny MNA dia mampitombo ny fifamatoran'ny Sp1 amin'ny mpandrindra TNFα, izay mitarika amin'ny fitomboan'ny fandikana TNFα sy ny famokarana cytokine TNFα. Ny MNA koa dia miteraka fihenan'ny IFN-γ. Ny fanakanana ny asan'ny sela T dia mitarika amin'ny fihenan'ny fahafahana mamono sy ny fitomboan'ny fivontosana haingana.
Araka ny tatitra, ny TNFα dia manana fiantraikany manohitra ny fivontosana sy manohitra ny fivontosana miankina amin'ny lafiny aloha sy aoriana, saingy manana anjara toerana fantatra tsara amin'ny fampiroboroboana ny fitomboana sy ny metastasis amin'ny homamiadan'ny ovaire (31-33). Araka ny tatitra, ny fifantohana TNFα ao amin'ny ascites sy ny sela fivontosana amin'ny marary voan'ny homamiadan'ny ovaire dia ambony noho ny ao amin'ny sela tsy manimba (34-36). Raha ny momba ny mekanisma, ny TNFα dia afaka mandrindra ny fampandehanana, ny fiasa ary ny fihanaky ny sela fotsy, ary manova ny endriky ny sela homamiadana (37, 38). Mifanaraka amin'ireo zavatra hita ireo, ny fanadihadiana momba ny fanehoana ny fototarazo samihafa dia naneho fa ny TNF dia nitombo be tao amin'ny sela T ao amin'ny sela fivontosana raha oharina amin'ny ascites (Sary 5C). Ny fitomboan'ny fanehoana ny TNF dia hita ihany amin'ny vondron'ny sela T manana endrika tsy cytotoxic (Sary S5A). Raha fintinina, ireo angon-drakitra ireo dia manohana ny fomba fijery fa ny MNA dia manana fiantraikany roa sosona amin'ny immunosuppressive sy ny fampiroboroboana ny fivontosana ao amin'ny HGSC.
Ny fametahana marika fluorescent mifototra amin'ny cytometry mikoriana no lasa fomba lehibe indrindra handinihana ny metabolisman'ny TIL. Ireo fanadihadiana ireo dia naneho fa raha ampitahaina amin'ny lymphocytes ra periferika na sela T avy amin'ny taova lymphoid faharoa, ny TIL amin'ny totozy sy ny olombelona dia manana fironana ambony kokoa amin'ny fandraisana gliokaozy (4, 39) ary ny fahaverezan'ny fiasan'ny mitochondria miandalana (19, 40). Na dia nahita vokatra mitovy amin'izany aza izahay tamin'ity fanadihadiana ity, ny fivoarana lehibe dia ny fampitahana ny metabolisman'ny sela fivontosana sy ny TIL avy amin'ny sela fivontosana iray ihany. Mifanaraka amin'ny sasany amin'ireo tatitra teo aloha ireo, ny sela fivontosana (CD45-EpCAM +) avy amin'ny ascites sy ny fivontosana dia manana fandraisana gliokaozy ambony kokoa noho ny sela CD8 + sy CD4 + T, izay manohana fa ny fandraisana gliokaozy avo lenta amin'ny sela fivontosana dia azo ampitahaina amin'ny sela T. Ny foto-kevitry ny fifaninanana sela T. TME. Na izany aza, ny asan'ny mitochondria amin'ny sela fivontosana dia ambony noho ny an'ny sela CD8 + T, fa ny asan'ny mitochondria dia mitovy amin'ny an'ny sela CD4 + T. Ireo valiny ireo dia manamafy ny lohahevitra mipoitra fa ny metabolisma oxidative dia zava-dehibe ho an'ny sela fivontosana (41, 42). Manoro hevitra ihany koa izy ireo fa ny sela CD8 + T dia mety ho mora voan'ny tsy fahatomombanan'ny oksizenina kokoa noho ny sela CD4 + T, na ny sela CD4 + T dia mety mampiasa loharanon-karbônina ankoatra ny gliokaozy mba hihazonana ny asan'ny mitochondria (43, 44). Tsara homarihina fa tsy nahita fahasamihafana teo amin'ny fandraisana gliokaozy na ny asan'ny mitochondria teo amin'ny sela CD4 + T effectors, ny fahatsiarovana T effector ary ny sela T central memory amin'ny ascites izahay. Toy izany koa, ny toetry ny fiovaovan'ny sela CD8 + T amin'ny fivontosana dia tsy misy ifandraisany amin'ny fiovan'ny fandraisana gliokaozy, izay manasongadina ny fahasamihafana lehibe eo amin'ny sela T novolena in vitro sy ny TIL olombelona in vivo (22). Ireo fandinihana ireo dia nohamafisina ihany koa tamin'ny fampiasana ny fizarana sela mandeha ho azy tsy mitanila, izay naneho bebe kokoa fa ny sela CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + manana fandraisana gliokaozy sy asa mitochondria ambony kokoa noho ny sela fivontosana dia miely patrana saingy manana mponina sela mavitrika metabolika. Ity mponina ity dia mety maneho ny subpopulation mety ho an'ny sela myeloid suppressor na sela dendritic plasmacytoid voafaritra ao amin'ny fanadihadiana scRNA-seq. Na dia samy voalaza aza fa hita tamin'ny fivontosan'ny ovaire olombelona ireo roa ireo [45], dia mbola mila asa fanampiny ny famaritana ity vondron'olona myeloid ity.
Na dia afaka manazava ny fahasamihafana ankapobeny eo amin'ny metabolisma gliokaozy sy oksidativa eo amin'ny karazana sela aza ny fomba mifototra amin'ny cytometry mikoriana, dia mbola tsy voafaritra ny metabolites marina vokarin'ny gliokaozy na loharanon-karbônina hafa ho an'ny metabolisma mitochondrial ao amin'ny TME. Ny fanendrena ny fisiana na ny tsy fisian'ny metabolites amin'ny subset TIL iray dia mitaky fanadiovana ny mponina sela avy amin'ny sela nesorina. Noho izany, ny fomba fanatsarana sela ampiarahina amin'ny spectrometry faobe dia afaka manome fahatakarana momba ny metabolites izay manankarena amin'ny fomba samihafa ao amin'ny sela T sy ny mponina sela fivontosana amin'ny santionan'ny marary mifanaraka. Na dia manana tombony aza ity fomba ity raha oharina amin'ny fanasokajiana sela miasa amin'ny fluorescence, dia mety ho voakasika ny tranomboky metabolites sasany noho ny fahamarinan-toerana anatiny sy/na ny tahan'ny fiovana haingana (22). Na izany aza, ny fomba fiasantsika dia afaka namantatra metabolites immunosuppressive roa fantatra, adenosine sy kynurenine, satria miovaova be izy ireo eo amin'ny karazana santionany.
Ny famakafakana metabonômika nataonay momba ny fivontosana sy ny karazana TIL dia manome fahatakarana bebe kokoa momba ny anjara asan'ny metabolites amin'ny TME ovaire. Voalohany, tamin'ny fampiasana cytometry mikoriana, dia voafaritray fa tsy nisy fahasamihafana teo amin'ny asan'ny mitochondria teo amin'ny fivontosana sy ny sela CD4 + T. Na izany aza, ny famakafakana LC-MS/MS dia naneho fiovana lehibe teo amin'ny habetsahan'ny metabolites teo amin'ireo mponina ireo, izay manondro fa ny fehin-kevitra momba ny metabolisman'ny TIL sy ny asany metabolika amin'ny ankapobeny dia mitaky fandikana tsara. Faharoa, ny MNA no metabolite manana fahasamihafana lehibe indrindra eo amin'ny sela CD45 sy ny sela T amin'ny ascites, fa tsy ny fivontosana. Noho izany, ny fizarazarana sy ny toerana misy ny fivontosana dia mety hisy fiantraikany samihafa amin'ny metabolisman'ny TIL, izay manasongadina ny mety ho tsy fitoviana amin'ny tontolo iainana iray. Fahatelo, ny fanehoana ny anzima mpamokatra MNA NNMT dia voafetra indrindra amin'ny CAF, izay sela fivontosana amin'ny ambaratonga kely kokoa, fa ny haavon'ny MNA azo tsikaritra dia hita ao amin'ny sela T avy amin'ny fivontosana. Ny fanehoana tafahoatra ny NNMT ao amin'ny CAF ovaire dia misy fiantraikany fantatra fa mampiroborobo ny homamiadana, ampahany noho ny fampiroboroboana ny metabolisman'ny CAF, ny fidiran'ny fivontosana ary ny metastasis (27). Na dia antonony aza ny haavon'ny TIL amin'ny ankapobeny, ny fanehoana ny NNMT ao amin'ny CAF dia mifandray akaiky amin'ny karazana mesenchymal Cancer Genome Atlas (TCGA), izay mifandray amin'ny vinavina ratsy (27, 46, 47). Farany, ny fanehoana ny anzima AOX1 tompon'andraikitra amin'ny fahasimban'ny MNA dia voafetra amin'ny mponina CAF ihany koa, izay manondro fa ny sela T dia tsy manana fahafahana manafoana ny MNA. Ireo valiny ireo dia manohana ny hevitra fa na dia ilaina aza ny asa fanampiny hanamarinana izany zavatra hita izany, ny haavon'ny MNA avo lenta ao amin'ny sela T dia mety manondro ny fisian'ny tontolo iainana CAF mampihena ny hery fiarovana.
Noho ny haavon'ny fanehoan'ny mpitatitra MNA ambany sy ny haavon'ny proteinina fototra tsy hita maso tafiditra amin'ny metabolisman'ny MNA, dia tsy ampoizina ny fisian'ny MNA ao amin'ny sela T. Na ny NNMT na ny AOX1 dia tsy hita tamin'ny alalan'ny fanadihadiana scRNA-seq sy ny qPCR kendrena amin'ny andiany roa tsy miankina. Ireo valiny ireo dia manondro fa ny MNA dia tsy vokarin'ny sela T, fa voaray avy amin'ny TME manodidina. Ny fanandramana in vitro dia mampiseho fa ny sela T dia mirona hanangona MNA avy any ivelany.
Ny fanadihadiana in vitro nataonay dia naneho fa ny MNA exogenous dia miteraka ny fanehoana ny TNFα ao amin'ny sela T ary mampitombo ny fifamatoran'ny Sp1 amin'ny mpandrindra TNFα. Na dia manana fiasa manohitra ny fivontosana sy ny fivontosana aza ny TNFα, amin'ny homamiadan'ny ovaire, ny TNFα dia afaka mampiroborobo ny fitomboan'ny homamiadan'ny ovaire (31-33). Ny fanafoanana ny TNFα amin'ny kolontsaina sela fivontosana ovaire na ny fanesorana ny famantarana TNFα amin'ny modely totozy dia afaka manatsara ny famokarana cytokine mamaivay vokatry ny TNFα ary manakana ny fitomboan'ny fivontosana (32, 35). Noho izany, amin'ity tranga ity, ny MNA avy amin'ny TME dia afaka miasa ho toy ny metabolite pro-inflammatoire amin'ny alàlan'ny mekanisma miankina amin'ny TNFα amin'ny alàlan'ny tadivavarana autocrine, ka mampiroborobo ny fisian'ny sy ny fiparitahan'ny homamiadan'ny ovaire (31). Mifototra amin'io mety ho izy io, ny fanakanana ny TNFα dia ianarana ho toy ny fanafody mety ho an'ny homamiadan'ny ovaire (37, 48, 49). Ankoatra izany, ny MNA dia manimba ny cytotoxicity an'ny sela CAR-T amin'ny sela fivontosana ovaire, izay manome porofo fanampiny momba ny fampihenana ny hery fiarovana vokatry ny MNA. Raha fintinina, ireo valiny ireo dia manondro modely iray izay ahafahan'ny fivontosana sy ny sela CAF mamoaka MNA ao amin'ny TME ivelan'ny sela. Amin'ny alàlan'ny (i) fanentanana ny fitomboan'ny homamiadan'ny ovaire vokatry ny TNF sy (ii) fanakanana ny asan'ny sela T cytotoxic vokatry ny MNA, dia mety hisy fiantraikany roa sosona amin'ny fivontosana izany (Sary 5D).
Ho famaranana, tamin'ny fampiharana ny fitambaran'ny fanatsarana sela haingana, ny filaharan'ny sela tokana ary ny mombamomba ny metabolika, ity fandalinana ity dia naneho ny fahasamihafana goavana eo amin'ny immunometabolomic eo amin'ny fivontosana sy ny sela ascites amin'ny marary HGSC. Ity fanadihadiana feno ity dia naneho fa misy fahasamihafana eo amin'ny fandraisana glucose sy ny asan'ny mitochondria eo amin'ny sela T, ary namantatra ny MNA ho metabolite mifehy ny hery fiarovana tsy miankina amin'ny sela. Ireo angon-drakitra ireo dia misy fiantraikany amin'ny fomba fiantraikan'ny TME amin'ny metabolisman'ny sela T amin'ny homamiadan'olombelona. Na dia efa voalaza aza ny fifaninanana mivantana amin'ny otrikaina eo amin'ny sela T sy ny sela homamiadana, ny metabolites dia afaka miasa ho toy ny mpandrindra ankolaka ihany koa mba hampiroboroboana ny fivoaran'ny fivontosana ary mety hanakana ny valin-kafatra fiarovana endogenous. Ny famaritana bebe kokoa ny anjara asan'ireo metabolites mifehy ireo dia mety hanokatra paikady hafa hanatsarana ny valin-kafatra fiarovana manohitra ny fivontosana.
Ny santionan'ny marary sy ny angon-drakitra ara-pitsaboana dia nalaina tamin'ny alàlan'ny tahiry sela homamiadana BC voamarina avy amin'ny Canadian Tissue Repository Network. Araka ny protocole neken'ny BC Cancer Research Ethics Committee sy ny University of British Columbia (H07-00463), ny santionan'ny marary sy ny angon-drakitra ara-pitsaboana rehetra dia nahazo fanekena an-tsoratra na nanda ny fanekena azy ireo amin'ny fomba ofisialy. Ny santionany dia voatahiry ao amin'ny BioBank voamarina (BRC-00290). Ny toetran'ny marary amin'ny antsipiriany dia aseho ao amin'ny Tabilao S1 sy S5. Ho an'ny cryopreservation, dia ampiasaina ny scalpel mba handravahana ny santionan'ny fivontosana amin'ny fomba mekanika ary avy eo dia atosiky ny sivana 100-micron mba hahazoana fampiatoana sela tokana. Ny ascites an'ny marary dia notifirina tamin'ny 1500 rpm nandritra ny 10 minitra tamin'ny 4°C mba hanesorana ny sela sy hanesorana ny supernatant. Ireo sela azo avy amin'ny fivontosana sy ny ascites dia notehirizina tao anaty serum AB olombelona 50% tsy mavitrika amin'ny hafanana (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) ary 10% dimethyl sulfoxide. Ireo fampiatoana sela tokana voatahiry ireo dia natsonika ary nampiasaina ho an'ny metabolomika sy ny famaritana metabolite voalaza etsy ambany.
Ny fitaovana feno dia misy RPMI 1640 0.22 μm voasivana 50:50 ampiana: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) ampiana serum AB olombelona 10% tsy miasa amin'ny hafanana (Sigma-Aldrich), Hepes 12.5 mM (Thermo Fisher Scientific), l-glutamine 2 mM (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), Penicillin Streptomycin (PenStrep) 1 x vahaolana (Thermo Fisher Scientific) ary 50 μMB-mercaptoethanol. Ny AimV (Invitrogen) dia ampiana Hepes 20 mM (Thermo Fisher Scientific) sy l-glutamine 2 mM (Thermo Fisher Scientific). Ny buffer fandokoana cytometer mikoriana dia misy saline phosphate buffered 0.22μm voasivana (PBS; Invitrogen) ampiana serum AB olombelona 3% tsy miasa amin'ny hafanana (Sigma). Ny buffer fanatsarana sela dia voaforon'ny PBS voasivana 0.22μm ary ampiana serum AB olombelona tsy miasa amin'ny hafanana 0.5% (Sigma-Aldrich).
Tao anatin'ny tontolo feno 37°C, dia nolokoina tamin'ny 10 nM MT DR sy 100 μM 2-NBDG nandritra ny 30 minitra ny sela. Avy eo, dia nolokoina tamin'ny loko viability eF506 tamin'ny 4°C nandritra ny 15 minitra ny sela. Avereno ampangotrahina ao amin'ny FC Block (eBioscience) sy Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) ny sela, afangaro amin'ny buffer fandokoana flow cytometer (araka ny torolalan'ny mpanamboatra), ary ampangatsiaho mandritra ny 10 minitra amin'ny mari-pana ao an-trano. Lokoy amin'ny andiana antibody (Tabilao S2) ny sela ao amin'ny buffer fandokoana flow cytometry amin'ny 4°C mandritra ny 20 minitra. Avereno ampangotrahina ao amin'ny buffer fandokoana flow cytometry (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuration) ny sela alohan'ny hanaovana fanadihadiana. Ampiasao ny SpectroFlo sy FlowJo V10 handinihana ny angon-drakitra momba ny isan'ny sela, ary ampiasao ny GraphPad Prism 8 hamoronana ny angon-drakitra. Nohavaozina araka ny log ny hamafin'ny fluorescence antonony (MFI) an'ny 2-NBDG sy MT DR, ary avy eo dia nampiasaina ny fitsapana t miaraka amin'ny sary mba handinihana ireo marary mifanaraka. Esory amin'ny fanadihadiana ny mponina rehetra manana tranga latsaky ny 40; ampidiro ny sandan'ny MFI 1 ho an'ny sanda ratsy rehetra alohan'ny hanaovana fanadihadiana statistika sy fanehoana an-tsary ny angon-drakitra.
Mba hanampiana ny paikady fanaraha-maso tanana amin'ny tontonana dingana etsy ambony, dia nampiasa ny fanamarihana feno nataon'ny hazo famerana endrika (FAUST) (21) izahay mba hanendrena ho azy ny sela amin'ny mponina rehefa avy nanafoana ny sela maty ao amin'ny FlowJo. Tantaninay tanana ny vokatra mba hampifangaroana ireo mponina izay toa tsy voazara tsara (fampifangaroana ny sela PD1+ sy ny sela fivontosana PD1) sy ireo mponina voatahiry. Ny santionany tsirairay dia misy sela mihoatra ny 2% eo ho eo, ho an'ny mponina 11.
Nampiasaina ny "Ficoll gradient density centrifugation" mba hanasarahana ny PBMC amin'ireo vokatra fanasarahana leukocyte (STEMCELL Technologies). Ny sela CD8 + T dia nalaina avy amin'ny PBMC tamin'ny fampiasana CD8 MicroBeads (Miltenyi) ary nohalehibeazina tao anaty "complete medium" tamin'ny fampiasana TransAct (Miltenyi) nandritra ny 2 herinandro araka ny toromariky ny mpanamboatra. Navela hijanona nandritra ny 5 andro tao anaty "complete medium" misy IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) ireo sela, ary avy eo dia nohetsehina indray tamin'ny TransAct. Tamin'ny andro faha-7, araka ny toromariky ny mpanamboatra, ny CD45 MicroBeads (Miltenyi) olombelona dia nampiasaina mba hanatsarana ny sela tamin'ny fihodinana telo misesy. Nozaraina ho an'ny fanadihadiana "flow cytometry" ireo sela (araka ny voalaza etsy ambony), ary sela iray tapitrisa nozaraina intelo ho an'ny fanadihadiana LC-MS/MS. Nokarakaraina tamin'ny LC-MS/MS ireo santionany araka ny voalaza etsy ambany. Notombananay ny sandan'ny metabolite tsy hita miaraka amin'ny isa ion 1.000. Ny santionany tsirairay dia amboarina araka ny isan'ny iôna manontolo (TIC), ovaina amin'ny fomba logaritmika ary amboarina ho azy ao amin'ny MetaboAnalystR alohan'ny hanaovana fanadihadiana.
Natsonika ny sela tokana tao amin'ny marary tsirairay ary nosivana tamin'ny alalan'ny sivana 40 μm ho lasa akora feno (araka ny voalaza etsy ambony). Araka ny protocole-n'ny mpanamboatra, dia nampiasaina mba hanatsarana ny santionany ho an'ny sela CD8+, CD4+ ary CD45- (eo ambony ranomandry) nandritra ny fihodinana telo nifanesy tamin'ny alalan'ny fisarahana vakana magnetika mampiasa MicroBeads (Miltenyi). Raha fintinina, averina averina averina ao anaty buffer fanatsarana sela (araka ny voalaza etsy ambony) ireo sela ary isaina. Nokosehina tamin'ny vakana CD8 olombelona, ​​vakana CD4 olombelona na vakana CD45 olombelona (Miltenyi) tamin'ny 4°C nandritra ny 15 minitra ireo sela, ary avy eo dia nosasana tamin'ny buffer fanatsarana sela. Ampandalovina amin'ny tsanganana LS (Miltenyi) ny santionany, ary angonina ireo ampahany tsara sy ratsy. Mba hampihenana ny faharetana sy hampitomboana ny dingana famerenana amin'ny laoniny ny sela, dia ampiasaina amin'ny fihodinana faharoa amin'ny fanatsarana CD4+ ny ampahany CD8, ary ampiasaina amin'ny fanatsarana CD45 manaraka ny ampahany CD4. Tazomy eo ambony ranomandry ny vahaolana mandritra ny dingana fisarahana.
Mba hanomanana ny santionany ho an'ny fanadihadiana metabolite, dia nosasana indray mandeha tamin'ny ranoka sira mangatsiaka ireo sela, ary nampiana 1 ml ny methanol 80% tamin'ny santionany tsirairay, avy eo dia nafangaro ary nangatsiaka tao anaty azota ranoka. Natao tsingerina mangatsiaka-mafana intelo ireo santionany ary notifirina tamin'ny 14.000 rpm nandritra ny 15 minitra tamin'ny 4°C. Ny ranoka ambonin'ny rano dia etona mandra-pahamaina. Naverina levona tao anaty asidra formika 0.03% 50 μl ireo metabolite, nafangaro tamin'ny vortex mba hampifangaroana, ary avy eo dia notifirina mba hanesorana ny poti-javatra.
Esory ireo metabolites araka ny voalaza etsy ambony. Afindrao ao anaty tavoahangy chromatography liquide avo lenta ny supernatant ho an'ny fikarohana metabolomika. Ampiasao ny protocole fitsaboana kisendrasendra mba hitsaboana ny santionany tsirairay amin'ny sela mitovy isa mba hisorohana ny fiantraikan'ny andiany. Nanao fanombanana qualitative ny metabolites manerantany izay navoaka teo aloha tao amin'ny AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50) izahay. Ny fanadihadiana chromatography sy ny fampidirana ny peak area dia natao tamin'ny fampiasana rindrambaiko MultiQuant version 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Nampiasaina hanombanana ny sandan'ny metabolite tsy hita ny isa ion 1000, ary ny TIC an'ny santionany tsirairay dia nampiasaina hikajiana ny velaran-tany ambony voarindra amin'ny metabolite tsirairay hita mba hanitsiana ireo fiovana nentin'ny fanadihadiana fitaovana avy amin'ny fanodinana santionany. Rehefa voarindra ny TIC, dia ampiasaina amin'ny fiovam-po logarithmic sy ny scaling tsipika mahazatra mandeha ho azy ny MetaboAnalystR(51) (parameter mahazatra). Nampiasa PCA miaraka amin'ny fonosana vegan R izahay mba hanaovana fanadihadiana fikarohana momba ny fahasamihafan'ny metabolome eo amin'ny karazana santionany, ary nampiasa fanadihadiana redundancy ampahany mba handinihana ireo marary. Ampiasao ny fomba Ward mba hanamboarana dendrograma sarintany hafanana mba hanangonana ny elanelana Euclidean eo amin'ny santionany. Nampiasa limma (52) izahay tamin'ny habetsahan'ny metabolite voarindra mba hamantarana ireo metabolite be dia be manerana ny karazana sela sy ny tontolo iainana bitika manontolo. Mba hanatsorana ny fanazavana, dia mampiasa ny parameter salan'isa vondrona izahay mba hamaritana ny modely, ary mandinika ny karazana sela ao amin'ny tontolo iainana bitika ho vondrona tsirairay (n = vondrona 6); ho an'ny fitsapana dikany, dia nanao fandrefesana miverimberina intelo ho an'ny metabolite tsirairay izahay Mba hisorohana ny famerenana diso, dia nampidirina ho sakana amin'ny famolavolana limma ny marary. Mba hijerena ny fahasamihafan'ny metabolites eo amin'ny marary samihafa, dia nanitsy ny modely limma izahay, anisan'izany ny marary, tamin'ny fomba raikitra. Mitatitra ny maha-zava-dehibe ny fifanoherana voafaritra mialoha eo amin'ny karazana sela sy ny tontolo manodidina ny Padj <0.05 izahay (fanitsiana Benjamini-Hochberg).
Taorian'ny fanatsarana ny hery tamin'ny fampiasana ny Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% ny fahavelomana), dia natao ny fandaharana transcriptome sela tokana tamin'ny ascites sy ny santionan'ny fivontosana velona sy mangatsiaka tamin'ny fampiasana protocole fanehoana gène 10x 5′. Nodinihina ny tranga dimy misy fivontosana sy ascites mifanaraka, na dia nisakana ny fampidirana azy aza ny fahavelomana ambany avy amin'ny santionan'ny fivontosana iray. Mba hahazoana safidy marary maromaro, dia nampiarahinay tao amin'ny lalan'ny mpanara-maso chromium 10x ny santionan'ny marary tsirairay, ary nodinihinay tsirairay ny ascites sy ny toerana misy ny fivontosana. Taorian'ny fandaharana [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), genome Quebec; [Salan'isa famakiana 73.488 sy 41.378 isaky ny sela ho an'ny fivontosana sy ascites]], nampiasa ny CellSNP sy Vireo (53) izahay (mifototra amin'ny CellSNP ho Ny SNP olombelona mahazatra (VCF) nomen'ny GRCh38 dia nomena famantarana mpamatsy. Mampiasa ny SNPRelate izahay mba hamaritana ny famantarana akaiky indrindra (IBS) amin'ny satan'ny genotype an'ny marary (IBS), tsy ahitana sela sy sela tsy voatendry fantatra ho duplexes ary ireo mpamatsy mifanaraka eo amin'ny ascites sy ny santionan'ny fivontosana (54). Mifototra amin'ity asa ity, dia nitazona tranga telo misy solontenan'ny sela betsaka ao amin'ny fivontosana sy ascites izahay ho an'ny fanadihadiana manaraka. Rehefa avy nanao dingana fanivanana faobe tao amin'ny fonosana BioConductor scater (55) sy scran (56), dia nahazo sela 6975 (sela 2792 sy 4183 avy amin'ny fivontosana sy ascites) ho an'ny fanadihadiana. Mampiasa ny clustering Louvain an'i igraph (57) momba ny tambajotra mpiara-monina akaiky indrindra (SNN) mifototra amin'ny elanelan'ny Jaccard amin'ny sela cluster amin'ny alàlan'ny fanehoana. Nohazavaina tamin'ny tanana ireo karazana sela mety ho hita mifototra amin'ny fanehoana ny fototarazo marika ary nojerena tamin'ny t-SNE. Ny sela T cytotoxic dia faritana amin'ny fanehoana ny CD8A sy GZMA, ankoatra ireo vondrona kely manana fanehoana proteinina ribosomal ambany. Nijery ny angon-drakitra navoakan'i Izar et al. (16) izahay, anisan'izany ny fampidirana ny t-SNE-ny, izay afaka mifehy ny fifandimbiasan'ny fanehoana eo amin'ny mari-pamantarana sela fiarovana sy ny fanehoana NNMT.
Nosarahina tamin'ny vokatra fanasarahana leukocyte (STEMCELL Technologies) tamin'ny alalan'ny Ficoll gradient density centrifugation ny PBMC. Nosarahina tamin'ny PBMC ny sela CD3 + tamin'ny alalan'ny fampiasana vakana CD3 (Miltenyi). Na teo aza na tsy teo ny MNA, dia nampandehanina tamin'ny alalan'ny CD3 mifamatotra amin'ny takelaka (5μg/ml), CD28 azo levona (3μg/ml) ary IL-2 (300 U/ml; Proleukin) ny sela CD3+. Tamin'ny andro farany nivelarana, dia nojerena tamin'ny alalan'ny flow cytometry ny fahavelomana (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) sy ny fihanaky ny sela (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific). Tombano ny fiasan'ny effector amin'ny alàlan'ny fanentanana ny sela amin'ny alàlan'ny PMA (20 ng/ml) sy ionomycin (1μg/ml) amin'ny alàlan'ny GolgiStop mandritra ny 4 ora, ary araho maso ny CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) ary TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD). Amporisiho ny sela qPCR sy ChIP amin'ny alàlan'ny PMA (20 ng/ml) sy ionomycin (1μg/ml) mandritra ny 4 ora. Nangonina talohan'ny sy taorian'ny fanentanana tamin'ny alàlan'ny PMA (20 ng/ml) sy ionomycin (1 μg/ml) nandritra ny 4 ora ny supernatant ELISA.
Araho ny protocole-n'ny mpanamboatra mba hanasarahana ny RNA amin'ny fampiasana ny RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Ampiasao ny QIAshredder (QIAGEN) mba hampitovy ny santionany. Ampiasao ny kitapo RNA ho cDNA avo lenta (Thermo Fisher Scientific) mba hanamboarana ADN mifameno (cDNA). Ampiasao ny TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) mba handrefesana ny fanehoan-kevitry ny fototarazo (araka ny protocole-n'ny mpanamboatra) miaraka amin'ireto probes manaraka ireto: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] ary Hs01010726_m1 (SLC22A2). Nampiharina tamin'ny rafitra PCR tena izy StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) tao amin'ny takelaka fiasan'ny MicroAmp haingana 96-lava (Applied Biosystems) miaraka amin'ny sarimihetsika optika MicroAmp ireo santionany. Ny sandan'ny Ct mihoatra ny 35 dia heverina ho mihoatra ny tokonam-baravaran'ny fahitana ary voamarika ho tsy azo tsikaritra.
Ataovy ny ChIP araka ny voalaza teo aloha (58). Raha fintinina, notsaboina tamin'ny formaldehyde (fifantohana farany 1.42%) ireo sela ary notehirizina tamin'ny mari-pana ao an-trano nandritra ny 10 minitra. Ampiasao ny buffer swelling fanampiny (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl ary 0.1% NP-40) eo ambony ranomandry mandritra ny 10 minitra, avy eo averina averina ao anaty buffer immunoprecipitation araka ny voalaza (58). Avy eo dia nojerena tamin'ny alalan'ny sonication ny santionany tamin'ireto tsingerina manaraka ireto: tsingerina 10 (pulses 20 1 segondra) ary fotoana statika 40 segondra. Ampidirina ao anaty vatana ny antibody ChIP-grade immunoglobulin G (Cell Signaling Technology; 1μl), histone H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) ary SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) miaraka amin'ny santionany amin'ny 4°CC hozongozonina mandritra ny alina. Ampidirina ao anaty vilany ny santionany amin'ny mari-pana 4°C miaraka amin'ny fihozongozonana malefaka mandritra ny adiny 1, avy eo ampiasao ny santionany chelex (Bio-Rad) mba hanatsarana ny ADN, ary ampiasao ny proteinase K (Thermo Fisher) ho an'ny fandevonan-kanina proteinina. Hita tamin'ny alalan'ny PCR ny mpandrindra TNFα: forward, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; mifanohitra amin'izany kosa, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (vokatra 207-bp). Novokarin'ny Image Lab (Bio-Rad) ireo sary ary nohamarinina tamin'ny alalan'ny rindrambaiko ImageJ.
Nangonina araka ny voalaza etsy ambony ny ranoka avy amin'ny kolontsaina sela. Natao araka ny fomba fiasan'ny mpanamboatra ny famaritana ny TNFα ELISA kit (Invitrogen), ny IL-2 ELISA kit (Invitrogen) ary ny IFN-γ ELISA kit (Abcam). Araka ny protocole-n'ny mpanamboatra, dia nohamainina tamin'ny 1:100 ny ranoka mba hamantarana ny TNFα sy IL-2, ary 1:3 mba hamantarana ny IFN-γ. Ampiasao ny EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) mba handrefesana ny absorbance amin'ny 450 nm.
Nosarahina tamin'ny vokatra fanasarahana leukocyte (STEMCELL Technologies) tamin'ny alalan'ny Ficoll gradient density centrifugation ny PBMC. Nosarahina tamin'ny PBMC ny sela CD3 + tamin'ny alalan'ny fampiasana vakana CD3 (Miltenyi). Na nisy na tsy nisy MNA aza, dia nohetsehina tamin'ny alalan'ny CD3 mifamatotra amin'ny takelaka (5μg/ml), CD28 mety levona (3μg/ml) ary IL-2 (300 U/ml; Proleukin) nandritra ny 3 andro ny sela CD3+. Rehefa afaka 3 andro, dia nangonina sy nosasana tamin'ny saline 0.9% ny sela, ary nangatsiaka tampoka ny pellet. Natao tamin'ny alalan'ny flow cytometry (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuration) ny fanisana sela tamin'ny alalan'ny 123count eBeads.
Ireo metabolita nalaina araka ny voalaza etsy ambony. Ny nalaina maina dia naverina namboarina tamin'ny fifantohana mitovy amin'ny sela 4000/μl. Diniho ny santionany amin'ny alàlan'ny chromatography dingana mivadika (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) sy ny tsanganana CORTECS T3 (2.1 × 150 mm, haben'ny poti 1.6-μm, haben'ny mason-koditra 120-Å; #186008500, Waters). Spectrometer mass polar (6470, Agilent), izay miasa amin'ny fomba tsara ny ionisation electrospray. Ny dingana finday A dia 0.1% asidra formika (ao amin'ny H2O), ny dingana finday B dia 90% acetonitrile, 0.1% asidra formika. Ny gradient LC dia 0 hatramin'ny 2 minitra ho an'ny 100% A, 2 hatramin'ny 7.1 minitra ho an'ny 99% B, ary 7.1 hatramin'ny 8 minitra ho an'ny 99% B. Avy eo dia avereno ampifandanjana amin'ny dingana finday A ny tsanganana amin'ny tahan'ny fikorianan'ny 0.6 ml/min mandritra ny 3 minitra. . Ny tahan'ny fikorianan'ny rano dia 0.4ml/min, ary hafanaina hatramin'ny 50°C ny efitrano tsanganana. Ampiasao ny fenitra simika madio an'ny MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) mba hamaritana ny fotoana fitazonana (RT) sy ny fiovan'ny rano (RT = 0.882 minitra, fiovan'ny rano 1 = 137→94.1, fiovan'ny rano 2 = 137→92, Fiovam-po 3 = 137→78). Rehefa mitranga amin'ny fotoana fitazonana marina ireo fifindrana telo ireo, dia ampiasaina amin'ny fandrefesana ny fifindrana 1 mba hahazoana antoka ny maha-tokana azy. Ny fiolahana mahazatra an'ny MNA (Toronto Research Chemical Company) dia novokarina tamin'ny alalan'ny fanalefahana enina mitohy amin'ny vahaolana tahiry (1 mg/ml) mba hahazoana fenitra 0.1, 1.0, 10 ary 100 ng/ml ary 1.0 sy 10μg/ml ranoka tsirairay avy. Ny fetran'ny fahitana dia 1 ng/ml, ary ny valiny linear dia eo anelanelan'ny 10 ng/ml sy 10μg/ml. Ny tsindrona santionany sy fenitra roa microliters tsirairay dia ampiasaina amin'ny fanadihadiana LC/MS, ary ny santionany fanaraha-maso ny kalitao mifangaro dia atao isaky ny tsindrona valo mba hahazoana antoka ny fahamarinan'ny sehatra fanadihadiana. Ny valin'ny MNA an'ny santionany sela rehetra notsaboina tamin'ny MNA dia tao anatin'ny elanelana linear an'ny fanadihadiana. Ny fanadihadiana ny angon-drakitra dia natao tamin'ny fampiasana rindrambaiko fanadihadiana quantitative MassHunter (v9.0, Agilent).
Ny fananganana αFR-CAR taranaka faharoa dia nalaina avy amin'i Song et al. (59). Raha fintinina, ny fananganana dia misy ireto votoaty manaraka ireto: filaharan'ny mpitarika CD8a, sombin-javatra miovaova tokana αFR manokana ho an'ny olombelona, ​​faritra CD8a hinge sy transmembrane, sehatra intracellular CD27 ary sehatra intracellular CD3z. Ny filaharan'ny CAR feno dia novokarin'ny GenScript, ary avy eo dia natambatra tao amin'ny vector fanehoan-kevitra lentiviral taranaka faharoa eo ambonin'ny kasety fanehoan-kevitra GFP izay nampiasaina hanombanana ny fahombiazan'ny transduction.
Ny Lentivirus dia novokarina tamin'ny alalan'ny transfection ny sela HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); ambolena ao amin'ny Dulbecco's modified Eagle medium misy 10% fetal bovine serum (FBS) sy 1% PenStrep, ary nampiasa CAR-GFP vector sy ny plasmids fonosana (psPAX2 sy pMD2.G, Addgene) mampiasa lipofection amine (Sigma-Aldrich). Ny supernatant misy viriosy dia nangonina 48 sy 72 ora taorian'ny transfection, voasivana, ary nohamafisina tamin'ny alalan'ny ultracentrifugation. Tehirizo amin'ny -80°C ny supernatant viraliny voatsindry mandra-pahatongan'ny transduction.
Sarahina amin'ny vokatra fanasarahana leukocyte mpanome salama (STEMCELL Technologies) amin'ny alalan'ny Ficoll gradient density centrifugation ny PBMC. Ampiasao ny positive selection CD8 microbeads (Miltenyi) mba hanasarahana ny sela CD8+ amin'ny PBMC. Amporisiho ny sela T amin'ny alalan'ny TransAct (Miltenyi) ary ao anaty medium TexMACS [Miltenyi; ampiana serum olombelona 3% tsy mavitrika amin'ny hafanana, PenStrep 1% ary IL-2 (300 U/ml)]. Efatra amby roapolo ora taorian'ny fanentanana, dia nafindra tamin'ny lentivirus (10 μl supernatant virosy mifantoka isaky ny sela 106) ny sela T. 1 ka hatramin'ny 3 andro aorian'ny famindrana amin'ny Cytek Aurora (amin'ny FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), tombano ny fanehoana GFP an'ny sela mba hampisehoana ny fahombiazan'ny famindrana farafahakeliny 30%.
Nokolokoloina nandritra ny 24 ora tao amin'ny Immunocult (STEMCELL Technologies; nasiana PenStrep 1%) ny sela CAR-T tamin'ireto fepetra manaraka ireto: tsy voatsabo, notsaboina tamin'ny adenosine 250 μM na MNA 10 mM. Taorian'ny fitsaboana mialoha, dia nosasana tamin'ny PBS ny sela CAR-T ary natambatra tamin'ny sela SK-OV-3 20.000 [ATCC; tao amin'ny medium McCoy 5A (Sigma-Aldrich) nasiana FBS 10% sy PenStrep 1% tamin'ny 10: Nohamafisina intelo ny tahan'ny effector amin'ny target 1 tao amin'ny medium Immunocult nasiana. Ny sela SK-OV-3 sy ny sela SK-OV-3 nolevonina tamin'ny saponin digitalis (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) no nampiasaina ho fanaraha-maso ratsy sy tsara. Rehefa afaka 24 ora niarahana namboly, dia nangonina ny ranoka natsonika ary norefesina araka ny toromariky ny mpanamboatra (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega) ny lactate dehydrogenase (LDH). Nohamainina 1:50 tao anaty buffer LDH ny ranoka natsonika LDH. Ny isan-jaton'ny famonoana dia norefesina tamin'ny fampiasana ity raikipohy manaraka ity: isan-jaton'ny famonoana = isan-jaton'ny fanitsiana / tahan'ny famonoana ambony indrindra x 100%, izay isan-jaton'ny fanitsiana = sela T miara-mamboly ihany, ary ny tahan'ny famonoana ambony indrindra = fanaraha-maso tsara-fanaraha-maso ratsy.
Araka ny voalaza ao amin'ny lahatsoratra na fitaovana ary fomba fiasa, ampiasao ny GraphPad Prism 8, Microsoft Excel na R v3.6.0 ho an'ny fanadihadiana statistika. Raha misy santionany maromaro angonina avy amin'ny marary iray ihany (toy ny ascites sy ny fivontosana), dia mampiasa fitsapana t miaraka isika na mampiditra ny marary ho toy ny vokatra kisendrasendra amin'ny modely linear na ankapobeny araka izay mety. Ho an'ny fanadihadiana metabolomika, ny fitsapana ny maha-zava-dehibe dia atao intelo.
Raha mila fitaovana fanampiny ho an'ity lahatsoratra ity dia jereo ny http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Lahatsoratra azon'ny rehetra idirana ity, zaraina araka ny fepetran'ny Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike, izay mamela ny fampiasana, fizarana ary famokarana amin'ny fitaovana rehetra, raha mbola tsy natao ho an'ny tombony ara-barotra ny fampiasana farany ary ny fototra iorenan'ny asa tany am-boalohany dia marina. Referansa.
Fanamarihana: Ny adiresy mailakao ihany no angatahinay aminao mba hahafantaran'ilay olona atolotrao ny pejy fa tianao ho hitany ilay mailaka ary tsy spam izany. Tsy haka adiresy mailaka izahay.
Ity fanontaniana ity dia ampiasaina hitsapana raha mpitsidika ianao ary hisorohana ny fandefasana spam mandeha ho azy.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (GBerardi Jones (GBerardi Jones), De Bellardini (GBerardi Jones) Phineas T. Hamilton (Phineas T.
Ny MNA dia mandray anjara amin'ny fampihenana ny hery fiarovana ataon'ny sela T ary maneho lasibatra immunotherapy mety ho an'ny fitsaboana ny homamiadan'ny olombelona.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (GBerardi Jones (GBerardi Jones), De Bellardini (GBerardi Jones) Phineas T. Hamilton (Phineas T.
Ny MNA dia mandray anjara amin'ny fampihenana ny hery fiarovana ataon'ny sela T ary maneho lasibatra immunotherapy mety ho an'ny fitsaboana ny homamiadan'ny olombelona.
©2021 American Association for the Advancement of Science. Zo rehetra voatokana. Ny AAAS dia mpiara-miasa amin'ny HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ary COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.