Misaotra anao nitsidika ny Nature.com. Voafetra ny fanohanana ny CSS amin'ny dikan-tranonkala ampiasainao. Ho an'ny traikefa tsara indrindra, manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na hamono ny fomba mifanaraka amin'ny Internet Explorer). Mandritra izany fotoana izany, mba hahazoana antoka fa mitohy ny fanohanana, dia hampiseho ny tranonkala tsy misy styles sy JavaScript izahay.
Tsy tahaka ny biby manana hazon-damosina, ny bibikely dia heverina betsaka fa tsy manana hormonina stéroïde firaisana ara-nofo izay mirona amin'ny lahy. Ao amin'ny Anopheles gambiae, ny stéroïde ecdysone 20-hydroxyecdysone (20E) dia toa nivoatra mba hifehy ny fivoaran'ny atody rehefa noforonin'ny vavy2 ary hamporisika ny vanim-potoana tsy mety amin'ny fanambadiana rehefa afindran'ny lahy amin'ny firaisana ara-nofo3. Satria ny fivoaran'ny atody sy ny fanambadiana dia toetra mampiavaka ny fananahana, ny fahatakarana ny fomba ampidiran'ny moka Anopheles vavy ireo famantarana hormonina ireo dia mety hanamora ny famolavolana fandaharan'asa fanaraha-maso ny tazomoka vaovao. Eto, dia ambaranay fa ireo fiasan'ny fananahana ireo dia fehezin'ny stéroïde firaisana ara-nofo miavaka amin'ny alàlan'ny tambajotra sarotra misy anzima ecdysteroid-activating/inactivating. Nahita ecdysone oxidized manokana ho an'ny lahy izahay, 3-dehydro-20E (3D20E), izay miaro ny ray aman-dreny amin'ny alàlan'ny fanakatonana ny fandraisana ara-nofo ny vehivavy aorian'ny famindrana ara-nofo sy ny fampahavitrihana amin'ny alàlan'ny dephosphorylation. Tsara homarihina fa ny famindrana 3D20E koa dia nahatonga ny fanehoana ny fototarazo fananahana izay mitazona ny fivoaran'ny atody mandritra ny aretina Plasmodium, izay miantoka ny fahasalaman'ny vehivavy voan'ny aretina. Ny 20E avy amin'ny vavy dia tsy miteraka firaisana ara-nofo. valiny, fa mamela ireo olona mifanambady hanatody rehefa voasakana ny kinase manakana ny 20E. Ny famantarana ity hormonina stéroïde ho an'ny bibikely lahy ity sy ny anjara asany amin'ny fandrindrana ny fandraisana ara-nofo ataon'ny vehivavy, ny fahavokarana ary ny fifandraisana amin'ny Plasmodium dia manondro ny mety hampihena ny fahombiazan'ny fananahan'ny moka mamindra tazomoka.
Mitombo indray ny tranganà tazomoka sy ny fahafatesana4 noho ny fanoheran'ny moka Anopheles amin'ny fanafody famonoana bibikely miely patrana, izay hany mpitondra ny katsentsitra tazomoka amin'ny olombelona. Ny biôlôjian'ny fifanambadian'ireo moka ireo dia lasibatra tena manintona ho an'ny fitsaboana tazomoka vaovao satria indray mandeha monja no mifanambadian'ny moka vavy5; ny fanaovana ity fifanambadian'olona tokana ity ho tsy misy bibikely dia mety hampihena ny isan'ny moka eny an-tsaha.
Manjary tsy afaka manao firaisana ara-nofo ny vehivavy rehefa avy mahazo hormonina stéroïde avo lenta avy amin'ny lehilahy. Nasehon'ny fanadihadiana fa ny antony mahatonga ny fahasarotana amin'ny fanambadiana bebe kokoa dia ny 20-hydroxyecdysone (20E), hormonina stéroïde fantatra kokoa amin'ny hoe mpandrindra ny tsingerin'ny fivalanan-dra amin'ny dingana larval. Ny fahafahan'ny lahy mamorona sy mamindra 20E dia nivoatra manokana tamin'ny karazana Anopheles izay anisan'ny subgenus Cellia7, izay miely patrana any Afrika ary ahitana ny mpitondra tazomoka mampidi-doza indrindra, anisan'izany ny Anopheles gambiae. Tsara homarihina indrindra izany satria amin'ireo karazana ireo dia mamokatra 20E ihany koa ny vavy aorian'ny fihinanana ra tsirairay, ary ny 20E no mitarika ny tsingerin'ny oogenesis (jereo ny ref. 8). Na izany aza, tsy dia fantatra loatra ny fomba ampidiran'ny vavy ny famantarana avy amin'ny loharano roa samihafa amin'ny ecdysone (famindrana lahy sy ny fampidirana sakafo ra) nefa tsy manimba ny fahafahany manambady. Raha ny marina, raha miteraka tsy fahazakana ara-nofo ny 20E vokarin'ny vavy, dia hitarika ho amin'ny tsy fahafahana miteraka amin'ny olona virjiny mihinana izany, fitondran-tena mahazatra amin'ireo moka ireo5.
Ny fanazavana mety ho azo atao dia ny hoe ny lahy A. gambiae dia mamindra ecdysone novaina manokana ho an'ny lahy, izay mampihetsika ny fizotran'ny famantarana ao amin'ny lalan-kizorana fananahana vehivavy, ka miteraka tsy fandriam-pahalemana. Na izany aza, na dia manana hormonina stéroïde maromaro aza ny vertebrates, toy ny estrogen sy androgen (nodinihina tao amin'ny ref. 9), araka ny fahalalantsika, dia mbola tsy hita ao amin'ny bibikely ny stéroïde misy androgen.
Nikasa ny hamantatra ny lisitry ny hormonina stéroïde ao amin'ny fihary lahy (MAG) an'ny A. gambiae matotra ara-nofo izahay mba hitadiavana stéroïde manovaova. Tamin'ny fampiasana chromatography liquide avo lenta miaraka amin'ny spectrometry mass tandem (HPLC-MS/MS) fa tsy ny fomba tsy dia voafaritra loatra nampiasaina teo aloha, dia nahita ecdysone (E) sy 20E tao amin'ity sela ity izahay, izay nanamafy ny valiny teo aloha. Na izany aza, ny santionany dia nofehezin'ny stéroïde phosphorylated oxidized, mifanaraka amin'ny raikipohy 3-dehydro-20E-22-phosphate (3D20E22P)12 (Sary 1). Ny endrika hafa dia ahitana ny 3-dehydro-20E (3D20E) sy 20E-22-phosphate (20E22P). Ny hamafin'ny famantarana HPLC-MS/MS an'ny 3D20E22P dia avo roa heny noho ny endriny dephosphorylated, 3D20E, ary avo telo heny noho ny an'ny E sy 20E (Sary 1). Na dia any amin'ny faritra hafa amin'ny vatana aza ary ny lalan-kizorana ambany kokoa amin'ny fananahana (LRT; Sary Extended Data 1a). Nandinika ecdysteroids tamin'ny lahy sy vavy vao nohidiana (<1 andro) ihany koa izahay ary nahita 3D20E sy 3D20E22P tao amin'ny MAG ihany; E, 20E ary 20E22P dia hita tamin'ny lahy sy ny vavy (Sary Extended Data 1b). Ireo angon-drakitra ireo dia manondro fa ny lahy lehibe A. gambiae dia mamokatra hormonina manovaova avo lenta ao amin'ny MAGs izay tsy vokarin'ny vavy.
Nosarahina tamin'ny lahy virjiny 4 andro (4 andro) sy ny vavy virjiny sy efa nivady (0.5, 3, ary 12 hpm) ny MAG sy ny LRT vavy (anisan'izany ny atria, ny vesicles seminal, ary ny parovarium). Nohadihadiana tamin'ny alalan'ny HPLC-MS/MS (salan'isa ± sem; t-test tsy misy mpivady, roa lafy, tahan'ny fahitana diso (FDR) nohavaozina; NS, tsy manan-danja; *P < 0.05, **P < 0.01. 3D20E: 3 ora vs. 0.5 ora, P = 0.035; 12 ora vs. 3 ora, P = 0.0015; 12 ora vs. 0.5 ora, P = 0.030. 3D20E22P: 3 ora vs. 0.5 ora, P = 0.25; 12 ora vs. 3 ora, P = 0.0032; 12 ora vs. 0.5 ora, P = 0.015). Avy amin'ny dika mitovy biolojika telo ny angon-drakitra. Ny velaran-tany ambony indrindra ho an'ny ecdysone tsirairay mahaliana dia nokajiana ary nohavaozina tamin'ny isan'ny moka. Ny Ecdysone dia aseho amin'ny loko toy izao manaraka izao: E, maitso; 20E, volomboasary; 20E22P, volomparasy; 3D20E, manga; 3D20E22P, mavokely. Ny sary kely dia mampitombo ny maridrefy eo amin'ny y-axis mba hampisehoana ny haavon'ny ecdysone ambany kokoa.
Mba handinihana raha toa ka afindra mandritra ny firaisana ny 3D20E22P sy 3D20E, dia nodinihinay ny LRT vavy tamin'ny fotoana samihafa taorian'ny firaisana. Na dia tsy hita tamin'ny virjiny aza ny ecdysone, dia nahita 3D20E22P betsaka tao amin'ny LRT izahay avy hatrany taorian'ny firaisana (0.5 ora taorian'ny firaisana, hpm), izay nihena rehefa nandeha ny fotoana, raha nitombo be kosa ny haavon'ny 3D20E (Sary 1). Tamin'ny fampiasana ny 3D20E namboarina simika ho fenitra, dia voafaritray fa ny haavon'ity hormonina stéroïde ity ao amin'ny LRT mpivady dia farafahakeliny avo 100 heny noho ny 20E (Tabilao Fanampiny 1). Noho izany, ny 3D20E22P no ecdysone lahy lehibe indrindra izay afindra any amin'ny LRT vavy mandritra ny firaisana, ary ny endriny tsy misy phosphorylation, 3D20E, dia lasa betsaka be rehefa afaka fotoana fohy aorian'ny firaisana. Izany dia manondro ny anjara toerana lehibe ho an'ny ecdysone farany amin'ny biolojian'ny vehivavy aorian'ny firaisana.
Rehefa avy namorona angon-drakitra momba ny RNA sequencing (RNA-seq) vaovao (Sary 2a), tamin'ny fampiasana fantsona bioinformatika namboarina manokana, dia nitady ny ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), ary ny ecdysone encoding 20E-modified phosphatase gene (EPP) izay aseho ao amin'ny sela fananahana izahay. Nahita ny gène EPP kandidà iray sy gène EcK roa mety ho (EcK1 sy EcK2) izahay, saingy tsy nahita gène EO kandidà tsara. Tsara homarihina fa ny gène EPP tsirairay dia aseho amin'ny ambaratonga avo (98.9th percentile) ao amin'ny MAG Gambiana fa tsy ao amin'ny LRT vehivavy (Sary 2b), mifanohitra amin'ny fanantenanay satria ny dephosphorylation an'ny 3D20E22P dia nitranga tao amin'ity sela vehivavy ity. Noho izany, mino izahay fa ny EPP lahy dia mety hafindra mandritra ny firaisana. Eny tokoa, nampiasa marika isotope stable in vivo izahay mba hanaronana ny proteinina vehivavy aorian'ny firaisana, anzima fantatry ny MS ao amin'ny atrium vehivavy (Sary 2c sy Tabilao Fanampiny 1). Ny fisian'ny Nohamafisina ihany koa ny EPP tao amin'ny MAG sy ny LRT vavy nivady (fa tsy virjiny) tamin'ny fampiasana antikôra manokana (Sary 2d).
a, Fantsona bioinformatika namboarina manokana mba hikarohana ireo fototarazo mamaritra ny EcKs, EOs, ary EPPs ao amin'ny sela fananahana amin'ny lahy sy ny vavy tsirairay. Ny isa eo akaikin'ny zana-tsipìka dia manondro ny isan'ny kandidà lahy sy vavy amin'ny dingana tsirairay. Ity fanadihadiana ity dia namantatra fototarazo EPP iray (EPP) sy fototarazo EcK iray (EcK1) izay miseho amin'ny lahy, ary fototarazo EcK iray (EcK2) izay miseho amin'ny lahy sy ny vavy saingy tsy mamokatra fototarazo EO kandidà. b, Sarintany mampitaha ny fanehoana ny fototarazo kandidà amin'ny sela virjiny (V) sy ny sela Anopheles gambiae (M) sy Anopheles albicans. Spca, fampiraisana; MAGs, fihary fanampiny amin'ny lahy; faritra hafa amin'ny vatana, anisan'izany ny nono, elatra, tongotra, vatana matavy, ary taova anatiny amin'ny lahy sy ny vavy, ary ny ovaire amin'ny vavy. Ny EcK2 dia hita betsaka ao amin'ny MAG sy ny atria any Gambia, raha ny EPP kosa dia hita ao amin'ny MAG ihany.c, Fanadihadiana proteomika momba ny fifindran'ny vondrona ejaculate lahy mankany amin'ny atria vavy amin'ny 3, 12 ary 24 hpm, izay mampiseho ny proteinina 67 be indrindra. Ny vavy dia notezaina tamin'ny sakafo misy 15N mba hanisy marika (sy hanaronana) ny proteinina rehetra. Ny lahy tsy misy marika dia nampiarahina tamin'ny vavy misy marika, ary ny LRT vavy dia notapatapahina tamin'ny 3, 12 ary 24 hpm ho an'ny fanadihadiana proteomika (jereo ny Tabilao Fanampiny 1 ho an'ny lisitra feno momba ny proteinina ejaculatory). Inset, EPP, Eck1 ary EcK2 dia hita tao amin'ny MAG an'ny lahy virjiny tamin'ny alàlan'ny fanadihadiana proteomika an'ireo sela ireo.d, EPP dia hita tamin'ny alàlan'ny western blot tao amin'ny MAG sy LRT an'ny vavy nampiarahina, fa tsy tamin'ny vavy virjiny na lahy na ny sisa amin'ny vatan'ny vehivavy. Ny membranes dia niaraka tamin'izay Nozahana tamin'ny anti-actin (fanaraha-maso ny enta-mavesatra) sy anti-EPP. Virjiny avokoa ny lahy rehetra. Jereo ny Sary Fanampiny 1 ho an'ny angon-drakitra avy amin'ny gel. Natao indroa ny Western blots ary mitovy ny vokatra azo.
Nohamarinina ny fiasan'ny ecdysteroid phosphophosphatase an'ny EPP taorian'ny famelomana azy tamin'ny alalan'ny HPLC-MS/MS niaraka tamin'ny 3D20E22P nalaina avy amin'ny MAG (Extended Data Fig. 2a). Ankoatra izany, rehefa nampangina ny EPP tamin'ny alalan'ny RNA-mediated interference (RNAi) izahay, dia nahita fihenana be teo amin'ny fiasan'ny phosphatase tao amin'ny sela fananahan'ireo lahy ireo (Sary 3a), ary ny vavy nivady tamin'ny lahy nampangina ny EPP dia naneho ampahany A ambany kokoa amin'ny 3D20E dephosphorylated (Sary 3b) na dia teo aza ny fampanginana ampahany ny fototarazo (Extended Data Fig. 2b,c). Mifanohitra amin'izany kosa, tsy nahita fiovana lehibe teo amin'ny tahan'ny 20E22P/20E tao amin'ireo moka ireo ihany izahay, izay mety manondro fa manokana ho an'ny 3D20E22P ny anzima (Sary 3b).
a, Fihenan'ny asan'ny phosphatase ao amin'ny MAG vokatry ny fampanginana ny EPP amin'ny fampiasana ARN EPP roa sosona (dsEPP) na fanaraha-maso ARN GFP roa sosona (dsGFP). Dobo MAG roapolo no nampiasaina tamin'ny replica tsirairay (P = 0.0046, fitsapana-t miaraka, roa lafy), asehon'ny teboka misaraka. b, Ny vavy mivady amin'ny lahy tsy voasakan'ny EPP dia manana ampahany ambany kokoa amin'ny 3D20E tsy misy phosphorylation amin'ny 3 hpm (P = 0.0043, fitsapana-t tsy miaraka, roa lafy), raha toa kosa ka tsy nisy fiantraikany tamin'ny haavon'ny 20E (P = 0.063, tsy miaraka). t-test, roa lafy). Aseho amin'ny salan'isa ± sem avy amin'ny vondrona telo misy vavy 13, 16 ary 19 avy ny angon-drakitra.c, Ny vavy nivady tamin'ny lahy tsy nampiasa EPP dia nanana taha ambony kokoa amin'ny firaisana indray (P = 0.0002, Fitsapana marina nataon'i Fisher, roa lafy). Voatery nivady aloha ny vavy mba hahazoana antoka ny sata maha-mpivady azy ireo; 2 andro taty aoriana, dia nifandray tamin'ny lahy hafa mitondra tsirinaina transgenic izy ireo mba hanombanana ny tahan'ny firaisana indray amin'ny alàlan'ny fitiliana PCR quantitative ny transgene. d, Ny vavy mihinana ra izay miara-mipetraka amin'ny lahy tsy misy EPP dia nihena be ny fahavokarana (P < 0.0001; fitsapana Mann-Whitney, roa lafy) ary nihena kely ny isan'ny atody (P = 0.088, fitsapana Mann-Whitney, roa lafy), raha toa kosa ka tsy nisy fiantraikany tamin'ny tahan'ny fanatodizana (P = 0.94, fitsapana marina an'i Fisher, roa lafy). Amin'ny tontonana rehetra, ny n dia maneho ny isan'ny santionan'ny moka tsy miankina amin'ny zavamananaina. NS, tsy manan-danja. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Manaraka izany, dia nodinihinay raha zava-dehibe amin'ny famporisihana ny fanoherana ny firaisana amin'ny vehivavy ny dephosphorylation ecdysone. Tsara homarihina fa ny vehivavy izay niray tamin'ny lahy lany EPP dia niray indray tamin'ny fatra ambony kokoa (44.9%) noho ny vehivavy fanaraha-maso (10.4%) rehefa nifandray tamin'ny lahy fanampiny (transgenic) (Sary 3c). Nahita fihenan'ny fahavokarana be ihany koa izahay (Sary 3d, havia) ary fihenan'ny isan'ny atody napetrak'ireo vavy ireo (Sary 3d, afovoany), raha toa kosa ka tsy voakasika ny isan-jaton'ny atody napetrak'ireo vavy (valinteny hafa ateraky ny vehivavy amin'ny alalan'ny firaisana )) (Sary 3d, havanana). Raha jerena ny maha-manokana ny EPP ho an'ny 3D20E22P, ireo valiny ireo dia manondro fa ny fiasan'ny 3D20E amin'ny alalan'ny EPP nafindra nandritra ny firaisana dia mety manana anjara toerana lehibe amin'ny fanakanana ny fandraisan'ny vehivavy ny firaisana bebe kokoa, fihetsika izay nolazaina teo aloha fa vokatry ny famindrana ara-nofo ny 20E. Noho izany, ity hormonina manokana ho an'ny lehilahy ity dia misy fiantraikany lehibe amin'ny fahavokarana vehivavy.
Manaraka izany, nampitaha ny asan'ny 20E sy 3D20E tamin'ny andrana tsindrona tamin'ny virjiny efa matotra ara-nofo izahay tamin'ny fampiasana 3D20E novokarina tamin'ny fomba simika (Sary 4a–c) sy 20E azo vidiana eny an-tsena. Hitanay fa ny 3D20E dia nahomby kokoa noho ny 20E tamin'ny fanakanana ny fahatsapan'ny vehivavy ny firaisana ara-nofo amin'ny fifantohana roa (Sary 4d). Tsara homarihina fa ny antsasaky ny haavon'ny fiziolojikan'ny 3D20E ao amin'ny LRT (1,066 pg taorian'ny tsindrona vs. 2,022 pg taorian'ny firaisana ara-nofo) dia nahatonga ampahany amin'ny vehivavy tsy mety mifindra izay avo 20 heny noho ny haavon'ny fiziolojikan'ny 20E (361 pg taorian'ny tsindrona) 24 ora taorian'ny tsindrona tamin'ny fifantohana ambony indrindra 18 pg taorian'ny firaisana ara-nofo; Tabilao 1). Mifanaraka amin'ny hevitra fa ny famindrana ara-nofo ny 20E dia tsy miteraka vanim-potoana tsy mety amin'ny fanambadiana, ary manondro ny 3D20E ho anton-javatra lehibe amin'ny fiantohana ny fifandraisan'ny ray aman-dreny sy ny zanaka. Ny 3D20E koa dia mavitrika kokoa noho ny 20E tamin'ny fanadihadiana fanatodizana tamin'ny vavy virjiny (Sary 4e), izay manondro fa ny tahan'ny fanatodizana ara-dalàna hitanay taorian'ny fampanginana ampahany ny EPP dia noho ny fisian'ny asa 3D20E sisa tavela izay mbola vokarin'ny anton-javatra vavy vokatry ny fanambadiana.
(a,b) 3D20E namboarina tamin'ny fomba simika avy amin'ny 20E (a) miaraka amin'ny fiovam-po/fahombiazana avo dia avo (angon-drakitra aseho ho salan'isa ± sem avy amin'ny fihetsika fananganana telo mahaleo tena) (b).c, Ny spektrum faobe (tapany ambany) dia mitovy tanteraka amin'ny ecdysone hita ao amin'ny LRT vavy nivady (tapany ambony).d, Raha ampitahaina amin'ny 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; Fitsapana marina an'i Fisher, roa lafy) ary 10% etanol (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; Fitsapana marina an'i Fisher, 2 lafy), raha toa ka ambony lavitra noho ny fanaraha-maso ny 20E amin'ny fatra ambony kokoa (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; Fitsapana marina an'i Fisher, 2 lafy).e, Ny tsindrona 3D20E dia nahatonga tahan'ny fanatodizana ambony kokoa tamin'ny vavy virjiny raha oharina amin'ny fanaraha-maso etanôla 10% (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; Fitsapana marina an'i Fisher, roa lafy), raha toa kosa ny 20E raha oharina amin'ny fanaraha-maso dia tamin'ny fatra ambony kokoa ihany (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; Fitsapana marina an'i Fisher, roa lafy). Ny 3D20E dia nahatonga tahan'ny fanatodizana ambony kokoa noho ny 20E amin'ny fatra ambony kokoa (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; Fitsapana marina an'i Fisher, roa lafy). Amin'ny tontonana rehetra, ny n dia maneho ny isan'ny santionan'ny moka tsy miankina amin'ny zavamananaina. NS, tsy manan-danja. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. Avy amin'ny famerenana telo ny angona.
Tao amin'ireo fanadihadiana teo aloha, dia voafaritray fa ny famindrana ara-nofo ny hormonina stéroïde dia miteraka ny fanehoana ny MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), gène fananahana vehivavy izay miaro ny A. gambiae vavy amin'ny aretina P. falciparum. Ny fatiantoka ara-pahasalamana ateraky ny 13, ilay katsentsitra mahafaty indrindra amin'ny olombelona, ​​dia vokatry ny aretina vokatry ny 13, izay katsentsitra mahafaty indrindra amin'ny olombelona. Noho ny maha-zava-dehibe ny MISO amin'ny fahasalaman'ny Anopheles amin'ny fananahana any amin'ny faritra misy tazomoka, dia nanapa-kevitra ny hamantatra izahay hoe hormonina 3D20E na 20E no miteraka ny fanehoana ity gène ity. Hitanay fa na dia ny tsindrona 20E aza dia miteraka manokana na mahery vaika kokoa ny mpandray hormonina nokleary (HR), toy ny HR3 sy HR4, ary ireo lasibatra stéroïde mahazatra, toy ny gène yolkogenic Vg14, 15, 16, ny MISO dia mahery kokoa noho ny 3D20E (Extended Data Fig. 3). Noho izany, ny famindrana ara-nofo an'ity hormonina stéroïde androgenic ity dia toa miteraka mekanisma izay miaro ny vavy amin'ny fatiantoka ateraky ny aretina katsentsitra. Ankoatra izany, ny 3D20E dia misy fiantraikany samihafa amin'ny isoforms roa amin'ny Ny mpandray E EcR, izay miteraka EcR-A ary manakana ny EcR-B, ary miteraka mafy kokoa ireo fototarazo hafa miteraka firaisana, anisan'izany ny HPX15, izay misy fiantraikany amin'ny fahavokarana vehivavy. Izany dia mety hanazava ny tsy fahafahana miteraka hita amin'ny vehivavy mifamatotra amin'ny lahy tsy misy EPP (Sary Fanazavana Fanampiny 3). Ireo angon-drakitra ireo dia manondro ny fisian'ny lalan-kizorana manaraka izay miasa kokoa noho ny hormonina ecdysone roa izay mety ho fototry ny fiasan'ny lahy sy ny vavy.
Manaraka izany, notsapainay ny fiasan'ireo fototarazo EcK roa voafaritra ao amin'ny fantsona bioinformatika anay. Ny fampanginana ny EcK1 na EcK2 dia niafara tamin'ny fahafatesana betsaka teo amin'ny lahy (Extended Data Fig. 4a), izay manambara fa ny phosphorylation ecdysone, ary noho izany ny tsy fahavitrihana, dia zava-dehibe amin'ny fahavelomana. Satria ny EcK2 dia naseho tamin'ny ambaratonga ambony kokoa noho ny EcK1 ary hita tao amin'ny MAGs tamin'ny alàlan'ny proteomics (Sary 2b,c sy Tabilao Fanampiny 2), dia nohamarininay ny asan'ny ecdysteroid kinase tamin'ny alàlan'ny fampidirana azy tamin'ny 20E, izay niafara tamin'ny phosphorylation 20E22P (Extended Data Fig. 2).4b). Rehefa nampiasa ny 3D20E ho toy ny substrate izahay, dia tsy afaka nahita ny vokatra phosphorylated 3D20E22P (Extended Data Fig. 4c), izay manambara fa ny 20E fa tsy ny 3D20E no mety ho lasibatra tian'ny EcK2.
Araka ny fanadihadiana RNA-seq nataonay, dia avo dia avo ihany koa ny fanehoana ny EcK2 tao amin'ny LRT an'ny vavy virjiny, izay namonoana azy taorian'ny firaisana (Sary 2b). Nohamafisinay ireo angon-drakitra ireo ary voafaritray fa tsy voakasiky ny fihinanana ra ny fanehoana ny EcK2 (Extended Data Fig. 5a). Raha nanitatra ny andrana MS voalohany nataonay izahay, dia voafaritray fa ny tampon'ny 20E22P dia mifandray akaiky amin'ny tampon'ny 20E (22-26 ora aorian'ny fihinanana ra; Extended Data Fig. 5b). Ny fampanginana ny EcK2 tamin'ny vavy virjiny dia nahatonga fitomboana in-3 heny amin'ny tahan'ny 20E amin'ny 20E22P amin'ny 26 ora aorian'ny fihinanana ra (Extended Data Figures 2c sy 5c), izay manamafy fa ny EcK2 koa dia mampiroborobo ny 20E amin'ny vavy. Tsara homarihina fa ny virjiny lany EcK2 dia nitazona ny fandraisana ara-nofo feno (Extended Data Fig. 5d,e), izay manondro bebe kokoa fa ny famokarana 20E amin'ny vavy dia tsy miteraka vanim-potoana tsy mety amin'ny firaisana. Na izany aza, ireo vavy ireo Nitombo be ny tahan'ny fanatodizana raha oharina amin'ny fanaraha-maso, miaraka amin'ny virjiny mihoatra ny 30% manatody (Extended Data Fig. 5f). Raha toa ka natao taorian'ny famahanana ra ny tsindrona Eck2 RNA (dsEcK2) roa sosona, dia tsy nitranga ny fanatodizana, ary tamin'izay fotoana izay dia nihena ny tampon'ny 20E noho ny fihinanana ra. Amin'ny ankapobeny, ireo valiny ireo dia manohana ny modely fa ny 20E novokarina taorian'ny fitsentsefana ra dia afaka miteraka fanatodizana, saingy rehefa tapaka ny sakana fanatodizana (EcK2 sy mety ho anton-javatra hafa) noho ny fanambadiana. Na ny tsindrona 20E na ny 3D20E dia tsy nanakana ny fanehoana EcK2 tamin'ny virjiny (Extended Data Fig. 5g), izay manondro fa misy anton-javatra hafa manelanelana ny fanakanana ity kinase ity. Na izany aza, ny haavon'ny 20E aorian'ny famahanana ra dia tsy ampy hiteraka tsy fahazoana aina amin'ny fanambadiana, fa vokatry ny titers avo amin'ny 3D20E nafindra ara-nofo.
Ny valin'ny fikarohanay dia manome fahatakarana manan-danja momba ny mekanisma mifehy ny fahombiazan'ny fananahan'ny A. gambiae. Nipoitra ny modely iray izay nivoaran'ny lahy mba hanamboarana titers avo lenta amin'ny 3D20E, ecdysone novaina manokana ho an'ny lahy izay miantoka ny maha-ray aman-dreny amin'ny alàlan'ny fampihenana ny fahatsapan'ny vavy amin'ny fanambadiana bebe kokoa. Mandritra izany fotoana izany, ireo mpitondra tazomoka ireo dia namorona rafitra mahomby ihany koa mba hampandeha ny 3D20E amin'ny vavy ho setrin'ny famindrana ara-nofo ny EPP manokana ho an'ny lahy. Raha ny fantatray, ity no ohatra voalohany amin'ny rafitra hormonina stéroïde tarihin'ny lahy sy vavy izay manao asa miavaka sy manan-danja amin'ny bibikely. Ny asan'ny ecdysone manokana ho an'ny lahy dia efa noheverina fa tsy voaporofo mazava tsara. Ohatra, ny petra-kevitra iray izay nolavina betsaka 18 dia ny hoe ireo asa ireo dia mety ho tanterahan'ny precursor 20E E1. Fantatra tsara fa ao amin'ny Drosophila, ny monandry dia ateraky ny famindrana ara-nofo ny peptides firaisana ara-nofo kely19,20 izay mifandray amin'ny neurons izay mamelona ny lalan-kizorana fananahan'ny vehivavy amin'ny alàlan'ny receptors peptide firaisana ara-nofo manokana21,22. Ilaina ny asa fanampiny mba hamaritana ny famantarana any aoriana. riandrano fehezin'ny 3D20E ao amin'ny A. gambiae vavy ary mba hamaritana raha azo tehirizina eo anelanelan'ny moka sy ny Drosophila ireo riandrano ireo.
Noho ny anjara toerana lehibe ananan'ny 3D20E amin'ny fahavokarana sy ny fitondran-tenan'ny vehivavy voafaritra tao amin'ny fanadihadianay, ny lalana mitondra mankany amin'ny fananganana sy ny fampahavitrihana ny 3D20E dia manolotra fahafahana vaovao ho an'ny paikady fanaraha-maso ny moka amin'ny ho avy, toy ny famokarana lahy tsy miteraka mifaninana amin'ny paikady teknolojia bibikely tsy miteraka. Ampiasaina amin'ny famoahana dia na hanahaka ny 3D20E amin'ny filalaovana virjiny. Mety ho nivoatra ny asan'ny lahy manokana an'ny 3D20E rehefa nahazo ny fahafahana mampivondrona ny tsirinainy ho ao anaty plugs fanambadiana ny A. gambiae sy ny karazana Cellia hafa, satria izany dia mamela ny famindrana mahomby ny hormonina sy ny anzima mampihetsika hormonina maro. Ho setrin'izany, ny fivoaran'ny 3D20E amin'ny fampiharana ny monandry dia manome fomba iray ho an'ny vavy (amin'ny alàlan'ny fanehoana avo lenta ny MISO) mba hanatsarana ny fahaizany miteraka any amin'ny faritra misy tazomoka betsaka, izay mandray anjara ankolaka amin'ny fifindran'ny Plasmodium. Koa satria hita fa misy fiantraikany lalina amin'ny fahaveloman'ny P. falciparum sy ny fitomboan'ny moka Anopheles vavy ny 20E vavy,24 ny lalan'ny hormonina steroid lahy sy vavy ankehitriny dia lafiny manan-danja amin'ny fifandraisan'ny moka sy ny katsentsitra.
Nobeazina tamin'ny fepetra mahazatra ho an'ny bibikely ny karazana A. gambiae G3 (26-28 °C, hamandoana 65-80%, vanim-potoana mazava/maizina mandritra ny 12:12 ora). Nomena sakafo trondro vovoka (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets ary Tetra Pond Sticks amin'ny tahan'ny 7:7:2) ny olitra. Nomena vahaolana dextrose 10% sy ran'olombelona isan-kerinandro ny moka lehibe (nodinihina ny singa ao amin'ny ran'olombelona). Nahazoana tamin'ny fanavahana ny lahy sy ny vavy amin'ny dingana pupal ny moka virjiny rehefa avy nojerena tamin'ny mikroskopia. Efa voalaza teo aloha ny lahy mitondra ny transgene DsRed.
Natao araka ny fomba voalaza teo aloha ny fanandramana firaisana an-tery. Ho an'ny firaisana voajanahary, ny vavy virjiny 4 andro dia notehirizina tamin'ny tahan'ny 1:3 tamin'ny lahy virjiny matotra ara-nofo nandritra ny roa alina. Ho an'ny fanandramana izay nanindrona dsEPP ny lahy, ny fampidirana azy ireo anaty tranom-borona dia nifanindry tamin'ny andro faha-3-4 taorian'ny tsindrona, rehefa nangina tanteraka ny asan'ny phosphatase (Sary Extended Data 2b).
Nozaraina ho lasa methanol 100% ny sela moka, ny faty sisa tavela (ny vatana sisa), na ny vatana manontolo ary nohafohezina tamin'ny alalan'ny "beader" (vakana fitaratra 2 mm, 2 400 rpm, 90 segondra). Ireto avy ny habetsahan'ny sela sy ny haben'ny methanol: ny vatana sisa, 50 amin'ny 1 000 µl; MAG, 50–100 80 µl; LRT vavy, 25–50 80 µl. Natao "extraction" methanol faharoa tamin'ny habetsahan'ny methanol mitovy amin'ny an'ny sela ny rano miangona. Nesorina tamin'ny alalan'ny "centrifugation" ny poti-sela. Natambatra ny methanol avy amin'ny fitrandrahana roa ary nohamainina tamin'ny alalan'ny "acide flow", avy eo dia naverina natsipy tao anaty rano misy methanol 80% ireto: ny vatana sisa, 50 µl; MAG sy LRT vavy, 30 µl.
Nohadihadiana tamin'ny alalan'ny "spectromètre de mass" (ID-X, Thermo Fisher) mifamatotra amin'ny fitaovana LC (Vanquish, Thermo Fisher) ireo santionany. Natsindrona tamin'ny tsanganana 3 µm, 100 × 4.6 mm (Inspire C8, Dikma) izay notazonina tamin'ny 25 °C ny santionany 5 µl. Ny dingana finday ho an'ny LC dia A (rano, asidra formika 0.1%) sy B (acetonitrile, asidra formika 0.1%). Toy izao ny fiovaovan'ny LC: 5% B mandritra ny 1 minitra, avy eo nitombo ho 100% B nandritra ny 11 minitra. Rehefa afaka 8 minitra amin'ny 100%, avereno ampifandanjana ny tsanganana amin'ny 5% B mandritra ny 4 minitra. Ny tahan'ny fikorianan'ny rano dia 0.3 ml min-1. Ny ionization ao amin'ny loharano MS dia tanterahina amin'ny alàlan'ny ionization electrospray mafana amin'ny fomba tsara sy ratsy.
Mandrefy angona ao amin'ny elanelana m/z manomboka amin'ny 350 ka hatramin'ny 680 amin'ny famaha 60.000 amin'ny fomba MS feno ny spektrometatra faobe. Nahazoana angona MS/MS tamin'ny [M + H]+ (lasibatra rehetra), [M - H2O + H]+ (lasibatra rehetra), ary [M - H]- (lasibatra misy phosphorylation) ny angona MS/MS. Nampiasaina ny angona MS/MS mba hanamafisana ny toetran'ny ecdysone an'ny lasibatra izay tsy nisy fenitra azo ampiasaina. Mba hamantarana ny ecdysteroids tsy lasibatra, dia nohadihadiana ny angona MS/MS ho an'ny tampon'ny HPLC rehetra miaraka amin'ny habetsahana mifandraika >15%. Hamarino amin'ny fampiasana ny fiolahana mahazatra noforonina avy amin'ny fenitra madio (20E, 3D20E) mba hikajiana ny habetsahana na ny fanalefahana tanteraka amin'ny santionany manokana iray (lasibatra hafa rehetra) mba hikajiana ny fitoviana amin'ny habetsahana hita ao amin'ny lahy iray. Ho an'ny 3D20E, ny fandrefesana dia natao tamin'ny fampiasana ny fitambaran'ireto adducts manaraka ireto: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Nalaina sy nohamarinina tamin'ny fampiasana Tracefinder (dikan-teny 4.1) ny angon-drakitra. Nohadihadiana tamin'ny fampiasana Xcalibur (dikan-teny 4.4) ny angon-drakitra MS/MS. Noharina tamin'ny fenitra tsirairay avy ny spektra MS an'ny E, 20E ary 3D20E. Nohadihadiana tamin'ny alalan'ny derivatization miaraka amin'ny reagent Girard ny 3D20E22P. Nohadihadiana tamin'ny tahan'ny m/z ny 20E22P.
Nodiovina avy amin'ny MAG ny 3D20E22P. Natao tamin'ny ambaratonga famakafakana ny fanadiovana tamin'ny fampiasana chromatograph liquid ultra-performance (Acquity, Waters) miaraka amin'ny detector quadrupole fass-based (QDa, Acquity, Waters) teo ambanin'ny fepetra LC mitovy amin'ny fanadihadiana HPLC-MS/MS. Natomboka ny fanangonana ampahany rehefa hita tamin'ny fotoana fitazonana mitovy amin'ny voafaritra teo aloha ny m/z mifanaraka amin'ny 3D20E22P. Avy eo dia nojerena tamin'ny HPLC-MS/MS ny fahadiovan'ny akora nalaina araka ny voalaza etsy ambony.
Nalaina avy amin'ny sela fananahana 10-12 na faritra hafa amin'ny vatana (tsy misy loha) ny ARN manontolo tamin'ny fampiasana TRI reagent (Thermo Fisher) araka ny toromariky ny mpanamboatra. Notsaboina tamin'ny TURBO DNase (Thermo Fisher) ny ARN. Noforonina tamin'ny fampiasana Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) ny cDNA araka ny toromariky ny mpanamboatra. Efa navoaka teo aloha ny Primers ho an'ny reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR; Extended Data Table 2) na noforonina tamin'ny fampiasana Primer-BLAST26, miaraka amin'ny safidy omena vokatra 70-150 bp ny habeny ary mivelatra amin'ny exon-exon junctions na Primer pair primers exons misaraka. Ny santionan'ny cDNA avy amin'ny replicates biolojika telo ka hatramin'ny efatra dia natsonika in-efatra tao anaty rano ho an'ny RT-qPCR. Ny fandrefesana dia natao tamin'ny fihetsika replicate 15 µl misy 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primers, ary 5 µl cDNA natsonika. Ny fihetsika dia natao tamin'ny QuantStudio 6 Pro. Nangonina sy nohadihadiana tamin'ny alalan'ny Design and Analysis (version 2.4.3) ny rafitra PCR amin'ny fotoana tena izy (Thermo Fisher) ary nohadihadiana ny angon-drakitra. Araka ny aseho ato amin'ity fandalinana ity, dia naverina tamin'ny laoniny ny habetsahana mifandraika amin'ny gène ribosomal RpL19 (AGAP004422), izay tsy niova firy ny fanehoany rehefa nihinana ra 27 na nivady 3.
Nojerena tamin'ny alalan'ny Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) ny kalitaon'ny ARN. Nomanina sy nojerena tao amin'ny Broad Institute an'ny MIT sy Harvard ny tranomboky Illumina paired-end. Nampifanarahina tamin'ny genome A. gambiae (karazana PEST, version 4.12) ny famakiana filaharana tamin'ny alalan'ny HISAT2 (version 2.0.5) miaraka amin'ny masontsivana mahazatra. Nesorina tamin'ny alalan'ny Samtools (version 1.3.1) ny famakiana miaraka amin'ny isa mapping quality (MAPQ) <30. Nisaina tamin'ny alalan'ny htseq-count (version 0.9.1) miaraka amin'ny masontsivana mahazatra ny isan'ny famakiana nohavaozina. Nokajiana ny isan'ny famakiana nohavaozina ary nohadihadiana ny fanehoana ny fototarazo samihafa tamin'ny alalan'ny fonosana DESeq2 (version 1.28.1) ao amin'ny R (version 4.0.3).
Ireo kandidà gène manova Ecdysone dia voafaritra tamin'ny fikarohana voalohany ny genome A. gambiae tamin'ny fampiasana ny algorithm PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), tamin'ny fampiasana ireo sanda mahazatra Parameters miaraka amin'ireto filaharan'ny proteinina ireto: avy amin'ny Bombyx mori (Laharana fidirana NP_001038956.1), Musca domestica (Laharana fidirana XP_005182020.1, XP_005175332.1 ary XP_011294434.1) ary Microplitis demolitor (Laharana fidirana XP_008552646.1 ary XP_008552645.1) EcK avy amin'ny B. mori (Laharana fidirana NP_001036900), Drosophila melanogaster (Laharana fidirana NP_651202), Apis mellifera (Laharana fidirana XP_394838) sy Acyrthosiphon pisum (Laharana fidirana XP_001947166); ary EPP avy amin'ny B. mori (Laharana fidirana XP_001947166) NP_001177919.1 sy NP_001243996.1) ary EO an'ny D. melanogaster (Laharana fidirana NP_572986.1) (dingana 1). Avy eo, sivana ny tifitra mifototra amin'ny fanehoana mRNA avo lenta (>100 sombin-javatra/kilobase exons isaky ny tapitrisa famakiana sarintany (FPKM) na >85%) ao amin'ny sela fananahana (LRT na MAG vavy) ao Gambia (dingana 2). Mba hanatsarana ny fahaiza-manao manokana, dia nifantina anzima kandidà izay hita ao amin'ny sela fananahan'ny A. albimanus ihany koa izahay, karazana anopheles izay tsy mamorona na mamindra ecdysone mandritra ny firaisana. Nosivana ireo fototarazo kandidà mifototra amin'ny fanehoana ambany (<100 FPKM na <85th percentile) ao amin'ny sela fananahan'ny A. albimanus (dingana 3). Amin'ny maha-sivana farany (dingana 4), ireo fototarazo kandidà dia mila mahafeno farafahakeliny iray amin'ireto manaraka ireto: (1) niakatra be taorian'ny firaisana (P < 0.05) araka ny fanadihadiana ireo fototarazo maneho fahasamihafana sy (2) ao amin'ny sela tsy miteraka (< 85% na <100 FPKM).
Novainay ny fomba voalaza teo aloha 28, 29, 30 mba hahazoana marika isotopic ho an'ny zavamananaina manontolo. Raha fintinina, ny Saccharomyces cerevisiae karazana II (YSC2, Sigma) karazana voajanahary dia notsapaina tamin'ny leviora azota fototra (BD Difco, DF0335) misy (wt/vol) glucose 2% (G7528, Sigma), 1.7% tsy misy asidra amine sy ammonium sulfate (mety ho an'ny fambolena) ary 5% 15N ammonium sulfate (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) ho hany loharanon'ny azota. Ny leviora dia nalaina tamin'ny alalan'ny centrifugation ary ny olitra moka dia nomena sakafo ad libitum mandra-pahatongan'ny pupation. Famenoana lafarinina trondro (0.5 mg isaky ny olitra 300) mba hisorohana ny fahafatesan'ny instar fahefatra. Ny vavy ihany no nampiasaina tamin'ny andrana fanambadiana tamin'ny lahy tsy misy marika mba handinihana ny proteome lahy nafindra nandritra ny fanambadiana.
Noterena hivady tamin'ny lahy virjiny tsy mbola nivady mitovy taona aminy ireo vavy virjiny 15N, 4-6 andro. Nohamarinina tamin'ny alalan'ny fahitana ireo "plugs" mampivady tamin'ny alalan'ny mikroskopia epifluorescence ny fahombiazana tamin'ny fampivadiana. Tamin'ny 3, 12, ary 24 hpm, dia notapatapahina tao anaty "buffer" ammonium bicarbonate 50 µl (pH 7.8) ny atria-n'ireo vavy 45-55 nivady ary nohafohezina tamin'ny "pestle". Nosantrifihana ny "homogenate" ary nafangaro tamin'ny 50 µl RapiGest 0.1% (186001860, Waters) tao anaty "ammonium bicarbonate" 50 mM ny "supernatant". Nangatsiaka tao anaty ranomandry maina ny "supernatant" sy ny "pellet" avy amin'ny santionany tsirairay ary nalefa nandritra ny alina tany amin'ny laboratoara MacCoss ao amin'ny Oniversiten'i Washington, izay nahavitana ny fanomanana ny santionany ho an'ny LC-MS/MS. Avereno averina ao anaty 50 µl RapiGest 0.1% ao anaty "ammonium bicarbonate" 50 mM ny "pellet" ary Sonika ao anaty rano fandroana. Ny fifantohan'ny proteinina ao amin'ny pellet sy ny supernatant dia norefesina tamin'ny alàlan'ny fanadihadiana BCA, ny santionany dia nahena tamin'ny 5 mM dithiothreitol (DTT; Sigma), alkylated tamin'ny 15 mM iodoacetamide (Sigma) ary notehirizina tamin'ny 37 °C (1:0 50) nandritra ny 1 ora miaraka amin'ny trypsinization: trypsin: substrate ratio). Ny RapiGest dia nopotehina tamin'ny fanampiana 200 mM HCl, narahin'ny incubation tamin'ny 37 °C nandritra ny 45 minitra ary centrifugation tamin'ny 14,000 rpm nandritra ny 10 minitra tamin'ny 4 °C mba hanesorana ny poti-javatra. Ny santionany dia nosasana tamin'ny alàlan'ny dual-mode solid-phase extraction (Oasis MCX cartridges, Waters) ary naverina natsipy tao anaty asidra formic 0.1% ho an'ny fifantohana proteinina farany 0.33 µg µl-1. Ny proteome MAG tsy misy marika dia nodinihina toy izany koa avy amin'ny lahy virjiny. Ny replicates analytical roa dia nodinihina ho an'ny tsirairay. santionany. Avy eo, nohadihadiana ny 1 µg tamin'ny tsirairay tamin'ny fampiasana tsanganana silika mivaingana 25 sm 75-μm miaraka amin'ny fandrika frit Kasil1 (PQ) silika mivaingana 4 sm feno resina Jupiter C12 reversed-phase (Phenomenex) sy chromatography ranoka 180 minitra. Famakafakana santionany – Ny MS/MS dia nojerena tamin'ny alalan'ny Q-Exactive HF mass spectrometer (Thermo Fisher) miaraka amin'ny nanoACQUITY UPLC System (Waters). Ny angon-drakitra momba ny fahazoana angon-drakitra novokarina isaky ny dingana dia novaina ho endrika mzML tamin'ny fampiasana Proteowizard (version 3.0.20287) sy ny fampiasana Comet31 (version 3.2) tamin'ny alalan'ny tahiry FASTA misy ny filaharan'ny proteinina avy amin'ny Anopheles gambiae (VectorBase version 54), Anopheles coluzzi. Nisy fikarohana natao tamin'ny Mali-NIH (VectorBase version 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Martsa 2021), A. gambiae RNA-seq, ary fandikan-teny telo-frame momba ny loto fantatra amin'ny olombelona. Ny FDR mifanaraka amin'ny sarintany peptide dia voafaritra tamin'ny fampiasana Percolator32 (version 3.05) miaraka amin'ny tokonam-baravarana 0.01, ary ny peptides dia natambatra ho famantarana proteinina amin'ny fampiasana proteinina parsimony ao amin'ny Limelight33 (version 2.2.0). Tombanana ny habetsahan'ny proteinina mifandraika amin'izany amin'ny fampiasana ny "normalized spectral abundance factor" (NSAF) izay kajy ho an'ny proteinina tsirairay isaky ny dingana araka ny voalaza teo aloha. Ny NSAF mifandraika amin'ny proteinina tsirairay dia nokajiana tamin'ny santionany avy amin'ny replica biolojika roa samihafa. Ny marika 15N dia nanarona tamim-pahombiazana ny proteome vavy, na dia azo hita aza ny proteinina tsy misy marika kely avy amin'ireo virjiny nasiana marika. Noraketinay ny fahitana ny fihenan'ny proteinina lahy (1-5 spectra) tamin'ireo santionany manta vavy tamin'ny dingana ara-teknika ihany, izay nanaovana santionany manta taorian'ny santionany lahy/mpivady, vokatry ny "fitondrana" HPLC. Ireo proteinina indraindray hita ho 'fandotoana' avy amin'ireo virjiny nasiana marika dia voatanisa ao amin'ny Tabilao Fanampiny 1.
Peptide antigenika roa, QTTDRVAPAPDQQQ (ao anatin'ny isotype PA) sy MESDGTTPSGDSEQ (ao anatin'ny isotype PA sy PB) ao amin'ny Genscript. Natambatra ireo peptide roa ireo, avy eo natambatra tamin'ny proteinina mpitatitra KLH ary nampidirina tao amin'ny bitro any Nouvelle-Zélande. Novonoina ireo bitro taorian'ny tsindrona fahefatra, ary ny IgG manontolo dia navahana tamin'ny alàlan'ny fanadiovana affinity. Ny IgG avy amin'ny bitro manokana indrindra amin'ny EPP dia nampiasaina ho an'ny western blotting fanampiny.
Ho an'ny western blots, ny MAG (n = 10, izay maneho ny isan'ny santionan'ny moka tsy miankina amin'ny zavamananaina ny n) sy ny LRT vavy (n = 30) avy amin'ny lahy virjiny 4 andro sy ny vavy virjiny na noterena hanao firaisana (<10 aorian'ny firaisana), ny buffer fanesorana proteinina (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% sodium deoxycholate; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× protease inhibitor cocktail (Roche)) dia nampiana misaraka. Ny santionany dia nohafohezina avy hatrany taorian'ny fandidiana tamin'ny beader (vakana fitaratra 2 mm, 2,400 rpm, 90 seg). Ny poti-javatra tsy mety levona dia nesorina tamin'ny alalan'ny centrifugation tamin'ny 20,000 g tamin'ny 4 °C. Ny proteinina dia norefesina tamin'ny alalan'ny Bradford assay (Bio-Rad). Avy eo, 20 µg ny proteinina MAG, 40 µg ny proteinina LRT, ary 20 µg ny proteinina sisa tavela dia nokapohina. nohafohezina sy nosarahina tamin'ny 10% Bis-Tris NuPAGE tamin'ny fampiasana buffer MOPS. Nafindra tany amin'ny fonon-drano polyvinylidene fluoride ny proteinina tamin'ny fampiasana ny rafitra famindrana iBlot2 (Thermo Fisher). Nosasana indroa tao amin'ny 1× PBS-T (0.1% Tween-20 ao amin'ny PBS) ny fonon-drano ary avy eo nosakanana tao amin'ny buffer Odyssey blocking (Li-Cor) nandritra ny 1 ora tamin'ny 22°C. Nohozongozonina nandritra ny alina tamin'ny 4°C ny fonon-drano tamin'ny alalan'ny antibody voalohany polyclonal anti-EPP bitro manokana (1:700 ao amin'ny buffer blocking) sy antibody voalohany monoclonal anti-actin rat anti-actin MAC237 (Abeam; 1:4,000). Nosasana tamin'ny PBS-T ny fonon-drano ary avy eo notehirizina tamin'ny antibody faharoa (ampondra anti-bitro 800CW sy osy anti-rat 680LT (Li-Cor), samy 1:20,000) tao amin'ny buffer blocking misy SDS 0.01% sy Tween -20 0.2% mandritra ny 1 ora amin'ny 22 °C. Nosasana tamin'ny PBS-T ireo fonon-damba ary nalaina sary tamin'ny alalan'ny scanner Odyssey CLx. Nangonina sy nokarakaraina tao amin'ny Image Studio (dikan-teny 5.2) ireo sary. Tsy hita ny tarika manokana mifanaraka amin'ny isoform EPP-RA (82 kDa).
Ny faritra fandikana ny EPP (toy ny isoform AGAP002463-RB misy ny histidine phosphatase domain, NCBI conserved domain search 34) sy EcK2 (AGAP002181) dia nalaina tao amin'ny pET-21a(+) plasmid (Novagen Millipore Sigma); Voatanisa ao amin'ny Tabilao Extended Data 2 ireo "primers". Nampidirina talohan'ny marika C-terminal 6xHis an'ny pET-21a(+)-EcK2 ny "primers". Novokarina tamin'ny alalan'ny NEBExpress cell-free E. coli protein synthesis reaction (New England BioLabs) ny proteinina recombinant. Nodiovina tamin'ny alalan'ny NEBExpress Ni spin columns (New England BioLabs) ny proteinina recombinant. Novokarina tamin'ny alalan'ny ADN template avy amin'ny NEBExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit ny proteinina. Notehirizina tao anaty glycerol 50% tao amin'ny PBS tamin'ny -20 °C nandritra ny 3 volana ny proteinina.
Norefesina tamin'ny alalan'ny 4-nitrophenyl phosphate (pNPP; Sigma-Aldrich) ny asan'ny phosphatase an'ny EPP sy ny nalaina avy amin'ny sela. Ny buffer fihetsika dia nisy 25 mM Tris, 50 mM asidra asetika, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, ary 1 mM DTT. Nohafohezina tao amin'ny buffer fihetsika ny sela ary nesorina tamin'ny alalan'ny centrifugation ny poti-sela. Atombohy ny fihetsika amin'ny fanampiana anzima na nalaina avy amin'ny sela ao amin'ny buffer fihetsika misy 2.5 mg ml-1 pNPP. Notehirizina tao anaty haizina tamin'ny mari-pana ao an-trano ny fangaro fihetsika, ary norefesina tamin'ny fandrefesana ny absorbance tamin'ny 405 nm tamin'ny fotoana samihafa ny habetsaky ny pNP niova avy amin'ny pNPP.
Ho an'ny asan'ny EcK in vitro, dia novolena tamin'ny 0.2 mg 20E na 3D20E tao anaty buffer 200 µl (pH 7.5) misy 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP ary 10 mM MgCl2 nandritra ny 2 ora tamin'ny 27 °C ny proteinina. Najanona ny fihetsika tamin'ny fanampiana methanol 800 µl, avy eo dia nangatsiaka tamin'ny -20 °C nandritra ny 1 ora, avy eo dia notsintrifugasi tamin'ny 20.000 g nandritra ny 10 minitra tamin'ny 4 °C. Avy eo dia nohadihadiana tamin'ny alalan'ny HPLC-MS/MS ny supernatant. Mba hampitsaharana ny fiasan'ireo proteinina ampiasaina ao amin'ny vondrona fanaraha-maso amin'ny hafanana, dia novolena tao anaty glycerol 50% tao amin'ny PBS nandritra ny 20 minitra tamin'ny 95 °C ireo proteinina.
Ho an'ny asan'ny EPP in vitro, ny proteinina dia novolena tamin'ny 3D20E22P (mitovy amin'ny habetsahana hita ao amin'ny MAG 18 tsiroaroa, nodiovina tamin'ny HPLC-MS/MS) tao anaty buffer 100 µl (pH 7.5) misy 25 mM Tris, 50 mM asidra asetika, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, ary 1 mM DTT nandritra ny 3 ora tamin'ny 27 °C. Najanona ny fihetsika tamin'ny fanampiana methanol 400 µl ary nangatsiaka tamin'ny -20 °C nandritra ny 1 ora, avy eo dia notifirina tamin'ny 20.000 g nandritra ny 10 minitra tamin'ny 4 °C. Nohadihadiana tamin'ny HPLC-MS/MS ny supernatant.
Nohamafisina avy amin'ny cDNA nomanina avy amin'ny fatin'ny moka tsy misy loha mifangaro lahy sy vavy ny sombin-PCR ho an'ny EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) ary EcK2 (556 bp). Nohamafisina avy amin'ny pCR2.1-eGFP voalaza teo aloha ny sombin-PCR an'ny fanaraha-maso eGFP (495 bp); Voatanisa ao amin'ny Tabilao Extended Data 2 ny "primer" PCR. Napetraka teo anelanelan'ny "promoters" T7 mivadika eo amin'ny plasmid pL4440 ny sombin-PCR. Nalaina avy amin'ny E. coli NEB 5-α (New England Biolabs) ny plasmid ary nohamarinina tamin'ny alalan'ny "sequencing" ADN talohan'ny fampiasana azy (jereo ny "Supplementary Data 1" ho an'ny "insert sequence"). Nampiasaina mba hanamafisana ny "insert" avy amin'ny plasmid miorina amin'ny pL4440 ny "primer" mifanaraka amin'ny "promoter" T7 (Tabilao Extended Data 2). Nohamafisina tamin'ny alalan'ny electrophoresis gel agarose ny haben'ny vokatra PCR. Nadika avy amin'ny môdely PCR ny dsRNA tamin'ny fampiasana ny Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) ary nodiovina araka ny torolalan'ny mpanamboatra miaraka amin'ireo fanovana voalaza teo aloha.
Ho an'ny tsindrona dsRNA, dia nampidirina tao amin'ny tratran'ny lahy na vavy lehibe (Nanoject III, Drummond) tamin'ny fifantohana 10 ng nl-1 ny dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) tao anatin'ny 1 andro taorian'ny eclosion. Ny haavon'ny fihenan'ny fototarazo dia voafaritra tamin'ny farafahakeliny telo replica biolojika tamin'ny alàlan'ny fitrandrahana RNA, ny fananganana cDNA, ary ny RT-qPCR. Ho an'ny tsindrona ecdysone, ny vavy virjiny 4 andro na 6 andro izay nohanin'ny ra dia nampidirina 0.13, 0.21, na 0.63 µg an'ny 20E na 3D20E (Nanoject III, Drummond) amin'ny fifantohana 1.3, 2.1, tsirairay avy, arakaraka ny endrika fanandramana na 6.3 ng nl-1. Ampidiro 100 nl ny etanôl 10% (vol/vol) ao anaty rano; 100 nl amin'ny 3D20E22P ao anaty etanôla 10% (mitovy amin'ny 75% amin'ny habetsahana hita ao amin'ny MAG roa). Nozaraina kisendrasendra tao amin'ny vondrona tsindrona ny moka.
Ho an'ny fanadihadiana momba ny fanatodizan'ny moka, dia nomena ran'olombelona tsy nisy oksizenina ireo moka vavy 3 andro. Esory ireo moka nohanina ampahany na tsy nohanina. Miankina amin'ny fitsaboana, dia napetraka tao anaty kaopy fanatodizan'ny moka ireo moka vavy nandritra ny efatra alina farafahakeliny 48 ora taorian'ny fihinanana ra. Nokajiana tamin'ny alalan'ny stereoscope (Stemi 508, Zeiss) ireo atody; ho an'ireo moka vavy efa nivady, dia noheverina ho lonaka ireo atody izay foy ho lasa olitra.
Ho an'ny andrana fampiraisana, dia navela farafahakeliny 2 andro ny vavy mba hampivelatra ny fanoherana ny fampiraisana, ary nampidirina tao amin'io tranom-borona io ihany koa ny lahy mitovy taona amin'ny karazana voajanahary. Roa alina taty aoriana, dia notapatapahina ireo vesicles vavy efa novolena ary navoaka ny ADN genomic tamin'ny alàlan'ny fampangatsiahana sy ny sonication tao anaty buffer misy 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, ary 25 mM NaCl (pH 8.2). Notehirizina tamin'ny Proteinase K (0.86 µg µl-1) nandritra ny 15 minitra tamin'ny 55 °C ny santionany, narahin'ny 10 minitra tamin'ny 95 °C. Nohavaozina in-10 ny fanomanana ADN genomic manta ary nosedraina tamin'ny qPCR ny filaharan'ny chromosome Y; voatanisa ao amin'ny Tabilao Extended Data 2 ny primers. Ny tsy fisian'ny filaharan'ny chromosome Y dia midika fa tsy misy fampiraisana.
Ho an'ny fanadihadiana famerenana ny firaisana, dia nojerena ny fisian'ny "pumps" ny vavy izay noterena hanao firaisana mba hanamafisana ny toetry ny firaisana ary navela 2 andro mba tsy hifanaraka amin'ny lahy, araka ny voalaza teo aloha 36. Avy eo dia nampidirina tao anaty tranom-borona vavy ny lahy mitondra tsirinaina transgenika DsRed. Roa alina taty aoriana, dia nesorina tamin'ny vavy ny vesicles fertilized, ary nomanina ny ADN genomic araka ny voalaza etsy ambony ary nojerena tamin'ny qPCR ny transgene DsRed; voatanisa ao amin'ny Tabilao Extended Data 2 ny primers. Ny tsy fisian'ny transgene DsRed dia manondro fa tsy nisy famerenana ny firaisana.
Noforonina araka ny voalaza teo aloha 37 ny 3D20E. Raha fintinina, 10 mg ny 20E (Sigma-Aldrich) no natsonika tao anaty rano 10 ml, narahin'ny fanampiana 30 mg ny platinum black (amin'ny endrika vovoka, Sigma-Aldrich). Nisy O2 niboiboika tsy an-kijanona tao anatin'ilay fangaro, izay nohetsehina tamin'ny mari-pana ao an-trano. Rehefa afaka 6 ora, dia nampiana methanol 30 mL mba hampijanonana ny fihetsiketsehana. Notsindrina ny fangaro mba hanesorana ireo poti-katalista. Navela ho maina tao anaty banga ny ranon-javatra tamin'ny mari-pana ao an-trano. Ny vokatra fihetsiketsehana maina dia natsonika tao anaty etanôla 10% sy methanol ho an'ny tsindrona ho an'ny fanadihadiana HPLC-MS/MS. Ny tahan'ny fiovam-po (avy amin'ny 20E mankany amin'ny 3D20E) dia teo amin'ny 97% teo ho eo (Sary 4b), ary ny spektrum MS an'ny 3D20E noforonina dia nifanaraka tamin'ny hita tamin'ny vavy nivady (Sary 4c).
Mirakitra antsipiriany manokana momba ireo fitsapana statistika natao ny fanazavana. Nampiasaina ny GraphPad (version 9.0) hanaovana ny fitsapana marina an'i Fisher, ny fitsapana Mantel-Cox, ary ny fitsapana t-Student. Natao tamin'ny alalan'ny script R manokana (hita ao amin'ny https://github.com/duopeng/mantelhaen.test) ny fitsapana Cochran-Mantel-Haenszel. Notsapaina ny ara-dalàna ny fizarana angona tamin'ny alalan'ny fitsapana Shapiro-Wilk miaraka amin'ny tokonam-baravaran'ny dikany 0.05. Rehefa tsy nahomby tamin'ny fitsapana ara-dalàna ny angona, dia natao ny fitsapana Mann-Whitney. Nohadihadiana ny angon-drakitra momba ny fahavelomana tamin'ny alalan'ny fitsapana Mantel-Cox. Nampiasaina ny fonosana DESeq2 (version 1.28.1) hanaovana fanadihadiana ny fanehoan-kevitra samihafa amin'ny ambaratongan'ny fototarazo RNA-seq. Ny bara mitsivalana eo amin'ny grafika dia maneho ny salan'isa. Ny sandan'ny dikany P = 0.05 no nampiasaina ho tokonam-baravaran'ny fitsapana rehetra.
Raha mila fanazavana fanampiny momba ny endriky ny fanadihadiana, jereo ny famintinana ny Tatitra Fikarohana Momba ny Nature mifandray amin'ity lahatsoratra ity.
Napetraka tao amin'ny ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) tamin'ny alalan'ny PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) ny angon-drakitra proteomika MS miaraka amin'ny famantarana angon-drakitra PXD032157.
Ny angon-drakitra RNA-seq dia napetraka ao amin'ny Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) eo ambanin'ny firaketana serial GSE198665.
Azo alaina avy amin'ireo mpanoratra mifandraika amin'izany ny angon-drakitra fanampiny novokarina sy/na nohadihadiana nandritra ny fanadihadiana ankehitriny raha misy fangatahana ara-drariny. Ity lahatsoratra ity no manome ny loharano.
De Loof, A. Ecdysteroids: Steroida firaisana ara-nofo amin'ny bibikely tsy raharahiana? Lahy: Black Box.Insect Science.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone sy ny fivoaran'ny ovaire ao amin'ny Anopheles stephens. J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).