Ny fanasokajiana proteinina ao amin'ny lalan'ny secretory dia tena ilaina amin'ny fitazonana ny fizarazarana sela sy ny homeostasis. Ankoatra ny fanasokajiana amin'ny alalan'ny akorandriaka, ny anjara asan'ny lipida amin'ny fanasokajiana kinesin amin'ny dingan'ny fitaterana secretory dia fanontaniana fototra efa ela izay mbola tsy voavaly. Eto izahay dia manao sary 3D miaraka amin'ny loko maro samihafa amin'ny fotoana tena izy mba hanaporofoana in vivo fa ireo proteinina glycosylphosphatidylinositol vao novokarina miaraka amin'ny lipid ceramide lava be dia voangona ary sokajiana ho endoplasma manokana. Toerana fivoahana Net, izay tsy mitovy amin'ny ampiasain'ny proteinina transmembrane. Ho fanampin'izany, asehonay fa ny halavan'ny rojo ceramide ao amin'ny fonon'ny reticulum endoplasmic dia tena ilaina amin'ity fifantenana fanasokajiana ity. Ny fianarantsika dia manome ny porofo mivantana voalohany in vivo hanasokajiana ny entan'ny proteinina mifototra amin'ny halavan'ny rojo lipida ho toerana fanondranana voafantina ao amin'ny lalan'ny secretory.
Ao amin'ny sela eukaryotic, ireo proteinina namboarina tao amin'ny reticulum endoplasmic (ER) dia sokajiana mandritra ny fitaterana amin'ny alàlan'ny lalan'ny secretory mba halefa any amin'ny toerana mety amin'ny sela (1). Ankoatra ny fanasokajiana amin'ny alalan'ny coat, dia efa ela no noheverina fa ny lipida sasany dia afaka miasa ho toy ny teboka fivoahana voafantina amin'ny alàlan'ny fampivondronana azy ireo ao anatin'ny sehatra membrane manokana izay proteinina manokana (2-5). Na izany aza, mbola tsy ampy ny porofo mivantana in vivo hanaporofoana ity mekanisma mifototra amin'ny lipida ity. Mba hamahana ity olana fototra ity, dia nianatra tao amin'ny leviora izahay ny fomba fanondranana proteinina glycosylphosphatidylinositol (GPI) (GPI-APs) avy amin'ny ER amin'ny fomba samihafa. Ny GPI-APs dia karazana proteinina mifandray amin'ny lipida amin'ny velaran'ny sela (6, 7). Ny GPI-AP dia proteinina miafina mifamatotra amin'ny takelaka ivelany amin'ny fonon'ny plasma amin'ny alàlan'ny ampahany glycolipid (GPI anchor). Manaiky ny GPI anchors ho toy ny fanovana post-translational ao amin'ny lumen ER izy ireo (8). Aorian'ny fifikirana, ny GPI-AP dia mandalo amin'ny fitaovana Golgi (5, 9) avy amin'ny ER mankany amin'ny fonon'ny plasma. Ny fisian'ny vatofantsika GPI dia mahatonga ny GPI-AP ho entina misaraka amin'ny proteinina nafenina transmembrane (anisan'izany ny proteinina fonon'ny plasma hafa) manaraka ny lalan'ny secretory (5, 9, 10). Ao amin'ny sela leviora, ny GPI-AP dia misaraka amin'ny proteinina nafenina hafa ao amin'ny reticulum endoplasmic, ary avy eo fonosina ao anaty vesicles miavaka nofonosin'ny coat protein complex II (COPII) (6, 7). Tsy mazava ny antony mamaritra ity dingana fanasokajiana ity amin'ny dingana fanondranana ER, saingy vinavinaina fa ity mekanisma ity dia mety mitaky lipida, indrindra ny fanavaozana ny rafitry ny ampahany lipida amin'ny vatofantsika GPI (5, 8). Ao amin'ny leviora, ny fanavaozana ny lipida GPI dia manomboka avy hatrany aorian'ny fifikirana amin'ny GPI, ary amin'ny tranga maro, dia mahatonga ny ceramide hifamatotra amin'ny asidra matavy rojo lava 26-karbônina (C26:0) (11, 12). Ny ceramide C26 no ceramide lehibe indrindra vokarin'ny sela leviora hatreto. Voaforona ao amin'ny ER izy io ary ny ankamaroany dia aondrana any amin'ny fitaovana Golgi amin'ny alàlan'ny vesicles COPII (13). Ny fanondranana ER ny GPI-AP dia mitaky manokana ny fananganana ceramide mitohy (14, 15), ary noho izany, ny fiovan'ny ceramide ho inositol phosphate ceramide (IPC) ao amin'ny fitaovana Golgi dia miankina amin'ny fananganana vatofantsika GPI (16). Ny fanadihadiana biofizika amin'ny fonon-taolana artifisialy dia naneho fa ny ceramide rojo acyl lava be dia afaka miray hina mba hamorona sehatra milamina miaraka amin'ny toetra ara-batana miavaka (17, 18). Ireo angon-drakitra ireo dia mitarika amin'ny petra-kevitra fa ny ceramide C26 sy GPI-AP miaraka amin'ny ceramide C26 dia mampiasa ny toetrany ara-batana mba hiray hina ho faritra na faritra milamina ao amin'ny tontolo lipida fonon-taolana ER somary mikorontana. Izy io dia ahitana glycerolipids fohy sy tsy mahavoky (C16:1 sy C18:1) (19, 20). Ireo faritra ireo dia hifantoka amin'ny toerana fivoahan'ny ER (ERES) manokana, izay ahafahana miara-mitatitra ny ceramide sy ny GPI-AP mifototra amin'ny ceramide mankany amin'ny Golgi ao amin'ny vesicle COPII natokana ho azy (5).
Ato amin'ity fandalinana ity, dia notsapainay mivantana ity mekanisma mifototra amin'ny lipida ity amin'ny alàlan'ny fampiasana mikroskopia sary tena izy (SCLIM), izay teknika mikroskopia farany izay afaka mandinika miaraka ireo proteinina misy marika fluorescent. Ny sary telo loko sy telo refy (3D) dia manana famaha sy hafainganam-pandeha avo lenta ao amin'ny sela velona (21, 22).
Nampiasa ny teknolojia SCLIM aloha izahay mba hamaritana bebe kokoa ny fomba nanasivanana ny GPI-AP ara-dalàna miaraka amin'ny vondrona ceramide C26 avy amin'ny proteinina nafenina transmembrane rehefa avy nandao ny ER tao amin'ny S. cerevisiae. Mba hanamarinana ny fanasokajiana ny ER, dia nampiasa rafitra fototarazo izahay izay afaka mijery mivantana ny entana vao novokarina niditra tao amin'ny ERES in vivo (7, 23). Ho entana, dia nifidy ny GPI-AP Gas1 miorina amin'ny ceramide C26 misy marika proteinina fluorescent maitso (GFP) sy ny proteinina nafenina transmembrane Mid2 misy marika proteinina fluorescent akaiky-infrared (iRFP) izahay, izay samy mikendry ny fonon'ny plasma (24–26). Ao amin'ny mutant sec31-1 saro-pady amin'ny mari-pana, ireo entana roa ireo dia aseho eo ambanin'ny mpandrindra galactose-inducible sy marika ERES. Amin'ny mari-pana tafahoatra (37°C), satria ny fiovan'ny sec31-1 dia misy fiantraikany amin'ny asan'ny singa coat COPII Sec31 mba hanakanana ny fitsimohan'ny COPII sy ny fanondranana ER, dia miangona ao amin'ny ER ny entana vao novokarina (23). Rehefa avy nangatsiaka tamin'ny mari-pana ambany (24°C), dia niverina avy tao amin'ny faritra miafina ireo sela niova sec31-1, ary nanomboka navoaka avy tao amin'ny ER ireo entana vaovao voangona. Ny sary CLIM dia naneho fa ny ankamaroan'ny Gas1-GFP sy Mid2-iRFP vao novokarina dia mbola niangona tao amin'ny ER an'ireo sela niova sec31-1 taorian'ny fandoroana tamin'ny 37°C ary avy eo dia navotsotra tamin'ny 24°C nandritra ny 5 minitra (Sary 1). Koa satria miparitaka manerana ny fonon'ny ER ny Mid2-iRFP, ary mifantoka sy miangona ao amin'ny faritra tsy mitohy amin'ny fonon'ny ER ny Gas1-GFP, dia samy hafa tanteraka ny fizarazarany (Sary 1, A hatramin'ny C ary Sarimihetsika S1). Ankoatra izany, araka ny aseho amin'ny Sary 1D, ny vondrona Gas1-GFP dia tsy manana Mid2-iRFP. Ireo valiny ireo dia manondro fa ny GPI-AP sy ny proteinina transmembrane dia nosarahina ho faritra samihafa amin'ny fonon'ny ER tany am-boalohany. Mifanila amin'ny ERES manokana misy marika proteinina mCherry's COPII coat Sec13 (Sary 1, E sy F, ary sarimihetsika S1) (23) ny vondron-tsimokaretina Gas1-GFP.
Ireo sela sec31-1 dia maneho tsiranoka vokatry ny galaktose, ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, maitso) sy ny proteinina transmembrane Mid2-iRFP (TMP, manga) ary ity marika ERES Constructive Sec13-mCherry (ERES, magenta) ity dia notehirizina tamin'ny 37°C nandritra ny 30 minitra, nafindra tany amin'ny 24°C, ary nalaina sary tamin'ny SCLIM 5 minitra taty aoriana. (A hatramin'ny C) dia mampiseho sary 2D mitambatra na tokana amin'ny fiaramanidina (A), sary projection 2D amin'ny fizarana z 10 (B) na sary 3D amin'ny ilabolan'ny sela amin'ny enta-mavesatra sy marika ERES (C). Bara mizana 1μm (A sy B). Ny singa mizana dia 0.551μm (C). Hita tao amin'ny faritra na vondrona ER misaraka ny Gas1-GFP, raha hita sy niparitaka nanerana ny fonon'ny ER kosa ny Mid2-iRFP (C). (D) Ny grafika dia mampiseho ny hamafin'ny fluorescence mifandraika amin'ny Gas1-GFP sy Mid2-iRFP ao amin'ny vondrona Gas1-GFP manaraka ny tsipika zana-tsipìka fotsy (ankavia). AU, singa tsy voafaritra. (E sy F) dia maneho ny sary 3D izay mampifangaro ny marika entana sy ERES. Hita akaikin'ny ERES manokana ny vondrona Gas1-GFP. Ny singa mizana dia 0.551μm. (F) Ny zana-tsipìka fotsy matevina dia manamarika ny vondrona Gas1-GFP mifandray amin'ny ERES. Ny tontonana afovoany sy havanana dia mampiseho ny sary 3D nohalehibeazina natambatra sy ny fijery mihodina amin'ny vondrona Gas1-GFP voafantina.
Ny fifandraisana akaiky eo amin'ny vondrona Gas1-GFP sy ny ERES manokana dia manondro fa ny Gas1-GFP dia afaka miditra amin'ny ERES voafantina, izay tsy mitovy amin'ny fifantenana ampiasain'ny Mid2-iRFP mba handaozana ny ER. Mba handaminana izany mety hitranga izany, dia nojerenay ny tahan'ny ERES ho an'ny entana iray na roa ihany (Sary 2, A hatramin'ny C). Hitanay fa ny ankamaroan'ny ERES (70%) dia misy karazana entana iray ihany. Ny sary ambany amin'ny Sary 2C dia mampiseho ohatra roa mahazatra amin'ny ERES miaraka amin'ny Gas1-GFP ihany (Sary 1) na Mid2-iRFP ihany (Sary 2). Mifanohitra amin'izany, eo amin'ny 20% eo ho eo amin'ny ERES no misy entana roa mifanindry ao amin'ny faritra iray ihany. Hita fa ny ERES sasany (10%) dia misy karazana entana roa, saingy mitokana any amin'ny faritra samy hafa mazava tsara izy ireo. Noho izany, ity fanadihadiana statistika ity dia mampiseho fa rehefa avy aondrana ny ER, ny GPI-AP Gas1-GFP sy ny entana transmembrane Mid2-iRFP dia mizara ho ERES samihafa (Sary 2D). Mifanaraka tsara amin'ny fanadihadiana biochemika teo aloha (6) sy ny famaritana morfolojika (7) ity fahombiazan'ny fanasokajiana ity. Afaka mandinika ny fihetsiky ny entana voatokana miditra ao amin'ny ERES ihany koa isika (Sary 2E sy Sarimihetsika S2). Ny Sary 2E dia mampiseho fa ampahany kely amin'ny Gas1-GFP (takelaka 3) na Mid2-iRFP (takelaka 4) ihany no miditra ao amin'ny ERES avy amin'ny lafiny iray ary voafetra amin'ny faritra mitokana. Ny Takelaka 5 amin'ny Sary 2E dia mampiseho fa ny Gas1-GFP sy Mid2-iRFP dia indraindray hita ao amin'ny ERES iray ihany, saingy miditra avy amin'ny lafiny samihafa izy ireo ary mifantoka amin'ny faritra misaraka izay mety maneho vesicles COPII samihafa. Nohamafisinay ihany koa fa ny fisarahana sy ny fanasokajiana ny GPI-AP Gas1 miorina amin'ny ceramide C26 ho ERES voafantina dia manokana satria ny entana famoahana transmembrane hafa, ny proteinina membrane plasma misy marika GFP Axl2 (27), dia mampiseho fihetsika mitovy amin'ny Mid2-iRFP. (Sary S1 sy Sarimihetsika S3). Ny Axl2-GFP vao novokarina dia zaraina amin'ny alalan'ny fonon'ny ER toy ny Mid2-iRFP (Sary S1, A sy B), ary miara-miasa amin'ny Mid2-iRFP ao amin'ny ankamaroan'ny ERES (Sary S1, B hatramin'ny D). Ny takelaka 1 sy 2 amin'ny Sary 1. Ny S1C dia mampiseho ohatra roa mahazatra amin'ny ERES izay mifanindry ny entana transmembrane roa. Amin'ireo tranga ireo, ireo entana roa ireo dia miara-miditra ao amin'ny ERES (Sary S1E, Takelaka 3 ary Sarimihetsika S3).
Napetraka tamin'ny 37 degre Celsius ireo sela sec31-1 izay maneho tsiranoka azo avy amin'ny galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, maitso) sy Mid2-iRFP (TMP, manga) ary marika ERES mandrafitra Sec13-mCherry (ERES, magenta). Rehefa avy notehirizina nandritra ny 30 minitra tamin'ny °C, dia afindra amin'ny 24 °C mba hamoahana ny sakana famoahana, ary sary amin'ny SCLIM rehefa afaka 20 minitra. (A hatramin'ny C) Sary fampisehoana 2D maneho (A; bara mizana, 1μm) na sary 3D amin'ny ilabolan'ny sela (B sy C; singa mizana, 0.456μm) an'ny entana sy fizarana z 10 voamariky ny ERES. Ny takelaka ambany ao amin'ny (B) sy ny takelaka ao amin'ny (C) dia mampiseho sary voahodina mba hampisehoana ireo entana hita ao amin'ny ERES (magenta) ihany [Gas1-GFP (volondavenona) sy Mid2-iRFP (manga mazava)]. (C) Zana-tsipìka misokatra: Ny ERES dia mitondra entana iray ihany (1 hatramin'ny 4). Zana-tsipìka volondavenona: Ny ERES dia misy entana misaraka (5). Zana-tsipìka fotsy matevina: Ny ERES dia misy entana miara-mipetraka. Ambany: Ny ERES tokana voafantina dia misy Gas1-GFP (1) na Mid2-iRFP (2) ihany. Bara mizana, 100 nm. (D) Fandrefesana ny sary mikrografy voalaza ao amin'ny (C). Ny isan-jaton'ny ERES izay misy entana iray ihany (Gas1-GFP na Mid2-iRFP), entana misaraka ary entana mifanindry. Amin'ny andrana telo mahaleo tena, n=432 amin'ny sela 54. Bara fahadisoana = SD. Fitsapana t roa tsy misy tsiroaroa. *** P = 0.0002. (E) Sary 3D an'ny ERES voafantina amin'ny entana voatokana voamarika amin'ny (C). Gas1-GFP (maitso) (3) na Mid2-iRFP (manga) (4) miditra amin'ny ERES (magenta) avy amin'ny lafiny iray ary voafetra amin'ny faritra kely ao anatin'ny ERES. Indraindray, samy miditra ao amin'ny ERES iray ihany (5) avy amin'ny lafiny iray ihany ireo karazana entana roa ireo ary voafetra ao amin'ny faritra mitokana ao anatin'ny ERES. Ambaratonga mizana, 100 nm.
Manaraka izany, dia notsapainay ny petra-kevitra fa ny ceramide lava acyl chain (C26) izay hita ao amin'ny fonon'ny ER no mitarika ny fivondronana sy ny fanasokajiana manokana ny Gas1 ho ao amin'ny ERES voafantina. Mba hanaovana izany, dia nampiasa karazana leviora novaina GhLag1 izahay, izay nosoloina GhLag1 (ny homologan'ny landihazo Lag1) ny synthases ceramide endogenous roa, ka nahatonga karazana leviora misy karazana Ceramide fonon'ny sela fohy kokoa noho ny karazana wild (Sary 3A) (28). Ny fanadihadiana momba ny spectrometry mass (MS) dia naneho fa amin'ny karazana wild, 95% amin'ny ceramide manontolo dia chain ceramide lava be (C26), raha ao amin'ny GhLag1 kosa, 85% amin'ny ceramide dia lava be (C18 sy C16). ), 2% amin'ny ceramide ihany no chain ceramide lava be (C26). Na dia ny ceramide C18 sy C16 aza no ceramide lehibe hita ao amin'ny fonon'ny GhLag1 hatreto, ny fanadihadiana MS dia nanamafy ihany koa fa ny vatofantsika GPI an'ny Gas1-GFP izay hita ao amin'ny karazana GhLag1 dia misy ceramide C26, izay azo ampitahaina amin'ny lipida karazana voajanahary. Mitovy ny kalitaony (Sary 3A) (26). Noho izany, midika izany fa ny anzima Cwh43, izay mamadika ny ceramide, dia tena mifantina tsara ho an'ny ceramide C26, araka ny aseho amin'ny Sary 26, izay mampiditra ny vatofantsika GPI avy amin'ny ceramide C26 kely ao amin'ny karazana GhLag1. S2 (29). Na izany aza, ny fonon'ny sela GhLag1 dia tsy misy afa-tsy ceramide C18-C16, raha mbola misy ceramide C26 ny Gas1-GFP. Izany dia mahatonga ity karazana ity ho fitaovana tsara indrindra hamahana manokana ny olan'ny halavan'ny rojo acyl an'ny ceramide fonon'ny ER. Ny anjara asan'ny kilasy sy ny fanasokajiana. Avy eo, nodinihinay aloha ny fahafahan'ny C26 Gas1-GFP miangona ao anaty vondrona ao amin'ny GhLag1 miaraka amin'ny allele mutant sec31-1 izay mora tohina amin'ny mari-pana amin'ny alàlan'ny mikroskopia fluorescence mahazatra, izay ahitana ny rojo lava (C18-C16) ihany ao amin'ny fonon'ny ER Ceramide (Sary 3). Hitanay fa ao amin'ny sec31-1, ny ankamaroan'ny Gas1-GFP dia mifantoka amin'ny vondrona, raha toa kosa ny Gas1-GFP ao amin'ny sec31-1 GhLag1 miaraka amin'ny fonon'ny ER ceramide lava (C18-C16) dia tsy miangona sy miparitaka ao amin'ny fonon'ny ER manontolo. Mba ho marina kokoa, satria mifandray akaiky amin'ny ERES manokana ny fivondronana mifototra amin'ny ceramide C26 (Sary 1), dia nodinihinay manaraka raha mety ahitana ny asan'ny mekanisma fanondranana proteinina ER ihany koa ity dingana ity. Mampiasa rafitra COPII manokana ho an'ny fanondranana ER ny GPI-AP, izay fehezin'ny fanavaozana ara-drafitra Ted1 amin'ny ampahany glycan amin'ny vatofantsika GPI (30, 31). Avy eo dia fantatry ny complexe p24 mpandray entana transmembrane ny GPI-glycan recombinant, izay avy eo dia misarika ny Lst1 amin'ny fomba voafantina, izay isoform manokana an'ny subunit lehibe COPII cargo binding Sec24, ka mamorona Vesicles COPII manankarena GPI-AP (31-33). Noho izany, dia nanamboatra mutant roa sosona izahay izay nampifangaro ny famafana ireo proteinina tokana ireo (ny singa complexe p24 Emp24, ny anzima fanavaozana GPI-glycan Ted1 ary ny subunit COPII manokana Lst1) miaraka amin'ny karazana mutant sec31-1, ary nandalina azy ireo. Azo atao ve ny mamorona Gas1-cluster GFP (Sary 3). Hitanay fa ao amin'ny sec31-1emp24Δ sy sec31-1ted1Δ, ny Gas1-GFP dia tsy voangona indrindra ary miparitaka manerana ny membrane ER, araka ny hita teo aloha tao amin'ny sec31-1 GhLag1, raha toa kosa ao amin'ny sec31-1lst1Δ, ny Gas1-GFP dia mitovy amin'ny sec31-1. Ireo valiny ireo dia manondro fa ankoatra ny fisian'ny C26 ceramide ao amin'ny fonon'ny ER, ny fivondronan'ny Gas1-GFP dia mila mifamatotra amin'ny complexe p24 ihany koa, ary tsy mitaky fandraisana Lst1 manokana. Avy eo, dia nojerenay ny mety ho vitan'ny halavan'ny rojo ceramide ao amin'ny fonon'ny ER mba handrindra ny fifandraisan'ny Gas1-GFP amin'ny p24. Na izany aza, hitanay fa ny fisian'ny C18-C16 ceramide ao amin'ny fonon'ny ER dia tsy misy fiantraikany amin'ny GPI-glycans natsangan'ny complexe p24 (Sary S3 sy S4, A sy B) na ny fifandraisana amin'ny GPI-AP sy ny fanondranana GPI-AP. Mitadiava karazana COPII Lst1 (Sary S4C). Noho izany, ny fivondronan'ny C26 miankina amin'ny ceramide dia tsy mitaky fifandraisana proteinina amin'ny mekanisma fanondranana proteinina ER samihafa, fa manohana mekanisma fanasokajiana hafa tarihin'ny halavan'ny lipida. Avy eo, dia nodinihinay raha zava-dehibe amin'ny fanasokajiana mahomby ny Gas1-GFP ho ERES voafantina ny halavan'ny rojo ceramide acyl ao amin'ny fonon'ny ER. Koa satria ny Gas1 ao amin'ny karazana GhLag1 miaraka amin'ny ceramide rojo fohy dia miala amin'ny ER ary miditra amin'ny fonon'ny plasma (Sary S5), mino izahay fa raha tarihin'ny halavan'ny rojo acyl ceramide ny fanasokajiana, dia azo averina averina sy ampiarahana ny Gas1 ao amin'ny karazana GhLag1. Entana ERES miaraka amin'ny fonon'ny sela mitovy.
(A) Ny fonon'ny sela GhLag1 dia ahitana ceramide C18-C16 fohy kokoa, raha toa kosa ny vatofantsika GPI an'ny Gas1-GFP dia mbola manana C26 IPC mitovy amin'ny sela wild-type. Ambony: famakafakana ny halavan'ny rojo acyl an'ny ceramide ao amin'ny fonon'ny sela wild-type (Wt) sy GhLag1p amin'ny alàlan'ny spectrometry mass (MS). Ny angon-drakitra dia maneho ny isan-jaton'ny ceramide manontolo. Ny salan'isa amin'ny andrana tsy miankina telo. Bara diso = SD. Fitsapana t roa tsy misy tsiroaroa. **** P <0.0001. Takelaka ambany: Famakafakana MS ny halavan'ny rojo acyl an'ny IPC misy ao amin'ny vatofantsika GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) izay aseho amin'ny karazana wild-type sy GhLag1p. Ny angon-drakitra dia maneho ny isan-jaton'ny famantarana IPC manontolo. Salan'isa amin'ny andrana tsy miankina dimy. Bara diso = SD. Fitsapana t roa tsy misy tsiroaroa. ns, tsy zava-dehibe. P = 0.9134. (B) Ireo mikrôgrafia fluorescence an'ny sela sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ ary sec31-1lst1Δ izay maneho Gas1-GFP vokatry ny galactose dia notehirizina tamin'ny 37°C nandritra ny 30 minitra ary nampitaina mba hanaovana mikroskopia fluorescence mahazatra aorian'ny 24°C. Zana-tsipìka fotsy: Vondron-tsampy ER Gas1-GFP. Zana-tsipìka misokatra: Ny Gas1-GFP tsy misy vondron-tsampy dia miparitaka manerana ny fonon'ny ER manontolo, mampiseho ny fandokoana peratra nokleary mampiavaka ny ER. Bara mizana, 5μm. (C) Fandrefesana ny mikrografia photomicrograph voalaza ao amin'ny (B). Ny isan-jaton'ny sela manana rafitra Gas1-GFP misy teboka. Amin'ny andrana telo mahaleo tena, n≥300 sela. Bara diso = SD. Fitsapana t roa tsy misy mpivady. **** P ＜0.0001.
Mba hamahana mivantana ity olana ity, dia nanao sary an-tsary SCLIM an'ny Gas1-GFP sy Mid2-iRFP tao amin'ny GhLag1 izahay miaraka amin'ny allele mutant sec31-1 izay mora tohina amin'ny hafanana (Sary 4 sy Movie S4). Rehefa avy nohazonina tamin'ny 37°C ny ER ary navoaka tamin'ny 24°C, dia tsy niangona na niparitaka nanerana ny fonon'ny ER ny ankamaroan'ny Gas1-GFP vao novokarina, araka ny hita tamin'ny mikroskopia mahazatra (Sary 4, A sy B). Ankoatra izany, ny ampahany betsaka amin'ny ERES (67%) dia ahitana karazana entana roa miara-mipetraka ao anatiny (Sary 4D). Ny takelaka 1 sy 2 amin'ny Sary 4C dia mampiseho ohatra roa mahazatra amin'ny ERES miaraka amin'ny Gas1-GFP sy Mid2-GFP mifanindry. Ankoatra izany, ireo entana roa ireo dia natambatra tao amin'ny ERES iray ihany (Sary 4E, takelaka 3 ary sarimihetsika S4). Noho izany, ny valin'ny fikarohanay dia manondro fa ny halavan'ny rojo ceramide acyl ao amin'ny fonon'ny ER dia mamaritra manan-danja ny fanangonana sy ny fanasokajiana ny proteinina ER.
Ireo sela Sec31-1 GhLag1 maneho tsiranoka vokatry ny galaktose, Gas1-GFP (GPI-AP, maitso) sy Mid2-iRFP (TMP, manga) ary Sec13-mCherry (ERES, magenta) misy marika ERES dia ampidirina ao anaty vatana amin'ny mari-pana 37°C. Tohizo mandritra ny 30 minitra, ahena ho 24°C mba hamoahana tsiranoka, ary sary amin'ny SCLIM rehefa afaka 20 minitra. (A hatramin'ny C) Sary fampisehoana 2D maneho (A; bara mizana, 1μm) na sary 3D amin'ny ilabolan'ny sela (B sy C; singa mizana, 0.45μm) amin'ny fizarana z 10 voamariky ny entana sy ERES. Ny takelaka ambany ao amin'ny (B) sy ny takelaka ao amin'ny (C) dia mampiseho sary voahodina mba hampisehoana ireo entana hita ao amin'ny ERES (magenta) ihany [Gas1-GFP (volondavenona) sy Mid2-iRFP (manga mazava)]. (C) Zana-tsipìka feno fotsy: ERES, mifanindry ny entana. Zana-tsipìka misokatra: ERES dia misy entana iray ihany. Tontonana ambany: Ny ERES voafantina dia misy entana mifanindry (1 sy 2) voamarika ao amin'ny (C). Bara mizana, 100 nm. (D) Fandrefesana ny sary mikrografy voalaza ao amin'ny (C). Ao amin'ny singa sec31-1 sy sec31-1 GhLag1, entana iray ihany (Gas1-GFP na Mid2-iRFP) no tafiditra, ary ny salan'isan'ny ERES ho an'ny entana mitokana sy entana mifanindry. Amin'ny andrana telo mahaleo tena, n = 432 amin'ny sela 54 (sec31-1) ary n = 430 amin'ny sela 47 (sec31-1 GhLag1). Bara diso = SD. Fitsapana t roa tsy misy mpivady. *** P = 0.0002 (sec31-1) ary ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Sary 3D an'ny ERES voafantina miaraka amin'ny entana mifanindry (3) voamarika ao amin'ny (C). Manatona ny ERES (magenta) avy amin'ny lafiny iray ihany ny Gas1-GFP (maitso) sy ny Mid2-iRFP (manga) ary mijanona ao amin'ny faritra voafetra ERES mitovy. Bara mizana, 100 nm.
Ity fanadihadiana ity dia manome porofo mivantana in vivo fa ny enta-mavesatry ny proteinina mifototra amin'ny lipida dia sokajiana ho toerana fanondranana voafantina ao amin'ny lalan'ny secretory, ary mampiseho ny maha-zava-dehibe ny halavan'ny rojo acyl ho an'ny fifantenana fanasokajiana. Amin'ny fampiasana teknika mikroskopia mahery vaika sy maoderina antsoina hoe SCLIM, dia nasehonay ny Gas1-GFP vao novokarina (GPI-AP membrane plasma lehibe misy ampahany lipida ceramide rojo acyl lava be (C26)) ao amin'ny leviora) Ny faritra miangona ao amin'ny ER misaraka dia mifandray amin'ny ERES manokana, raha toa kosa ny proteinina nafenina transmembrane dia miparitaka manerana ny membrane ER (Sary 1). Ho fanampin'izany, ireo karazana entana roa ireo dia miditra amin'ny ERES samihafa amin'ny fomba voafantina (Sary 2). Ny halavan'ny rojo acyl an'ny ceramide sela ao amin'ny membrane dia mihena avy amin'ny C26 mankany amin'ny C18-C16, ny cluster Gas1-GFP dia tapaka ao amin'ny faritra ER misaraka, ary ny Gas1-GFP dia averina alefa mba handao ny ER miaraka amin'ny proteinina transmembrane amin'ny alàlan'ny ERES mitovy (Sary 3 sy Sary 3). 4).
Na dia mampiasa mekanisma proteinina manokana aza ny GPI-AP mba hialana amin'ny ER, dia hitanay fa ny fisarahana miankina amin'ny C26 ceramide dia tsy miankina amin'ny fifandraisana proteinina samihafa izay mety hitarika amin'ny manokana ERES (Sary S4 sy S5). Ny zavatra hitanay kosa dia manohana mekanisma fanasokajiana hafa tarihin'ny fivondronan'ny proteinina mifototra amin'ny lipida sy ny fanilihana ireo entana hafa. Ny fandinihanay dia manondro fa ny faritra na vondrona Gas1-GFP mifandraika amin'ny ERES manokana dia tsy manana ny proteinina Mid2-iRFP nafenina transmembrane, izay manondro fa ny vondrona GPI-AP miankina amin'ny C26 ceramide dia hanamora ny fidirany ao amin'ny ERES mifandraika amin'izany, ary miaraka amin'izay koa, manilika ny transmembrane. Ny tsiambaratelo dia miditra amin'ity ERES manokana ity (Sary 1 sy 2). Mifanohitra amin'izany, ny fisian'ny ceramide C18-C16 ao amin'ny fonon'ny ER dia tsy mahatonga ny GPI-AP hamorona faritra na vondrona, ka tsy manilika na manolo ny proteinina nafenina transmembrane ao amin'ny ERES mitovy izy ireo (Sary 3 sy 4). Noho izany, manolo-kevitra izahay fa ny C26 ceramide no mitarika ny fisarahana sy ny fanasokajiana amin'ny alàlan'ny fanamorana ny fivondronan'ireo proteinina mifandray amin'ny ERES manokana.
Ahoana no fomba hahatratrarana ity fivondronana miankina amin'ny ceramide C26 ity ao amin'ny faritra ER manokana? Ny fironan'ny ceramide membrane hisaraka amin'ny lafiny iray dia mety hahatonga ny GPI-AP sy ny ceramide C26 hamorona lipida kely sy milamina avy hatrany ao amin'ny tontolo lipida tsy ara-dalàna kokoa ao amin'ny membrane ER misy glycerolipids fohy kokoa sy tsy mahavoky. Vondrona tsara kalitao (17, 18). Ireo vondrona kely vetivety ireo dia azo ampiarahina bebe kokoa ho vondrona lehibe kokoa sy marin-toerana kokoa rehefa avy mifamatotra amin'ny complexe p24 (34). Mifanaraka amin'izany, nasehonay fa ny C26 Gas1-GFP dia mila mifandray amin'ny complexe p24 mba hamorona vondrona hita maso lehibe kokoa (Sary 3). Ny complexe p24 dia oligomer heterozygous izay ahitana proteinina transmembrane p24 efatra samihafa ao amin'ny leviora (35), izay manome fifamatorana multivalent, izay mety hitarika amin'ny fifandraisana amin'ny vondrona GPI-AP kely, ka miteraka vondrona Stable lehibe kokoa (34). Ny fifandraisana misy eo amin'ny ectodomains proteinina an'ny GPI-APs dia mety handray anjara amin'ny fanangonana azy ireo ihany koa, araka ny aseho mandritra ny fitaterana Golgi ao amin'ny sela epithelial polarised mammalian (36). Na izany aza, rehefa misy ceramide C18-C16 ao amin'ny fonon'ny ER, rehefa mifamatotra amin'ny Gas1-GFP ny complex p24, dia tsy hisy vondrona lehibe misaraka hiforona. Ny mekanisma fototra dia mety hiankina amin'ny toetra ara-batana sy simika manokan'ny ceramide rojo acyl lava. Ny fanadihadiana biofizika momba ny fonon'ny artifisialy dia mampiseho fa na dia mety hiteraka fisarahana dingana aza ny ceramide rojo acyl lava (C24) sy fohy (C18-C16), ny ceramide rojo acyl lava (C24) ihany no afaka mampiroborobo ny Curvature avo sy ny fiolahana sarimihetsika mba hamerenana ny endrika sarimihetsika. Amin'ny alàlan'ny fifandraisana mifamadika (17, 37, 38). Naseho fa ny helix transmembrane an'ny TMED2, ny homologue olombelona an'ny Emp24, dia mifandray amin'ny sphingomyelin mifototra amin'ny ceramide C18 ao amin'ny lobules cytoplasmic (39). Amin'ny fampiasana simulation molekiola (MD), dia hitanay fa samy miangona manodidina ny lobules cytoplasmique an'ny helix transmembrane Emp24 ny ceramides C18 sy C26, ary mitovy ny safidiny (Sary S6). Tsara homarihina fa midika izany fa ny helix transmembrane an'ny Emp24 dia mety hiteraka fizarana lipida tsy mitovy ao amin'ny membrane. Vokatra vao haingana mifototra amin'ny sela mammals izany. Ny simulation MD mitovy amin'izany koa dia mampiseho ny fisian'ny lipida ether (40). Noho izany, dia heverinay fa manankarena eo an-toerana ny ceramide C26 ao amin'ny lobules roa an'ny ER26. Rehefa mifamatotra mivantana amin'ny p24 multivalent ny GPI-AP ao amin'ny lobules luminal ary ny fiangonan'ny ceramide C26 manodidina ny p24 ao amin'ny lobules cytoplasmique, dia afaka mampiroborobo ny fitambaran'ny proteinina miaraka aminy sy ny fiolahana membrane izay vokarin'ny rantsantanana (41), ka mahatonga ny GPI-AP hisaraka ho faritra misaraka mifanila amin'ny ERES, izay mankasitraka ihany koa ny faritra miolikolika be amin'ny membrane ER (42). Nanohana ny mekanisma naroso ireo tatitra teo aloha (43, 44). Ny fifamatoran'ny oligolectins, pathogens na antibodies amin'ny glycosphingolipids (GSL) miorina amin'ny ceramide eo amin'ny fonon'ny plasma dia miteraka fifangaroan'ny GSL lehibe, mampitombo ny fisarahana dingana ary miteraka fiovaovan'ny endrika sy ny fampidirana anatiny ny fonon'ny sela (44). Iwabuchi sns. (43) Hita fa eo anatrehan'ny rojo acyl lava (C24) fa tsy fohy (C16), ny ligand multivalent mifamatotra amin'ny GSL lactosylceramide dia nahatonga ny fiforonan'ny vondrona lehibe sy ny invagination ny fonon'ny sela, ary ny fifindran'ny famantarana Lyn-mediated cytoplasm eo amin'ny takelaka dia interdigitated amin'ny rojo acyl ao amin'ny neutrophils mifamatotra.
Ao amin'ny sela epithelial polarisée mammals, ny fifantohan'ny tambajotra anti-Golgi (TGN) hatramin'ny haavon'ny membrane plasma apical no mifehy ny fisarahana sy ny fanasokajiana ny GPI-AP (10, 45). Io fitambarana io dia entin'ny oligomerization GPI-AP (36), saingy mety hiankina amin'ny halavan'ny rojo ceramide hitantsika amin'ny leviora ihany koa izany. Na dia manana vatofantsika mifototra amin'ny lipida etera aza ny GPI-AP mammals, ary ny firafiny simika dia tena hafa noho ny ceramide rojo acyl lava be, ny fanadihadiana vao haingana dia nahita fa samy manana toetra ara-batana sy simika mitovy amin'ny evolisiona sy ny asany (40) ny lipida roa. Noho izany, ny ampahany lipida etera ao amin'ny sela mammals dia mety hitovy amin'ny ceramide C26 ao amin'ny leviora, ary ny anjara asany dia ny mifandray amin'ny ceramide rojo lava ao amin'ny membrane mba hampiroboroboana ny fitambarana sy ny fanasokajiana ny GPI-AP. Na dia mbola mila andramana mivantana aza io mety ho izy io, ny fikarohana teo aloha dia manohana fa ny fitaterana ny ceramide rojo acyl lava mankany amin'ny vatan'ny Golgi dia tsy tanterahan'ny proteinina famindrana cytoplasmic, fa miankina amin'ny fananganana vatofantsika GPI toy ny leviora. Noho izany, ny mekanisma evolisionera mpitahiry dia toa afaka miara-mitatitra amin'ny alalan'ny fifantenana ny ceramide acyl chain lava be sy ny GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) ao anaty vesicle fitaterana iray ihany.
Ao amin'ny rafitry ny sela epithelial polarisée sy ny mammalian, ny fanangonana sy ny fisarahana amin'ny proteinina membrane plasma hafa dia mitranga alohan'ny hahatongavana any amin'ny velaran'ny sela. Paladino et al. (48) dia nahita fa amin'ny TGN an'ny sela epithelial polarisée mammalian, ny fivondronan'ny GPI-AP dia tsy ilaina fotsiny amin'ny fanasokajiana voafantina ny GPI-AP amin'ny membrane plasma apical, fa mandrindra ihany koa ny fandaminana ny fivondronan'ny GPI-AP sy ny asany biolojika. Velaran'ny sela. Ao amin'ny leviora, ity fanadihadiana ity dia naneho fa ny vondrona GPI-AP miankina amin'ny ceramide C26 eo amin'ny ER dia afaka mandrindra ny fandaminana ny vondrona sy ny asan'ny GPI-AP eo amin'ny membrane plasma (24, 49). Mifanaraka amin'ity modely ity, ny sela GhLag1 dia mahazaka ny inhibitors GPI na fanafody izay misy fiantraikany amin'ny fahamarinan'ny rindrin'ny sela (28), ary ny filàna vondrona Gas1-GFP miasa (49) amin'ny tendrony ceramide aseho amin'ny fifandraisan'ny sela leviora dia manondro G​​​ Mety ho vokatry ny sela hLag1 ara-batana. Fahadisoan'ny GPI-AP. Na izany aza, ny fitsapana fanampiny raha toa ka efa voarindra avy amin'ny ER amin'ny alalan'ny fomba fanasokajiana mifototra amin'ny halavan'ny lipida ny fandaminana ny fiasan'ny velaran'ny sela no ho lohahevitry ny fikarohanay amin'ny ho avy.
Ireo karazana Saccharomyces cerevisiae ampiasaina amin'ity asa ity dia voatanisa ao amin'ny Tabilao S1. Ny karazana MMY1583 sy MMY1635 an'ny SCLIM ho an'ny sary sela velona dia namboarina tao ambadiky ny W303. Ireo karazana maneho Sec13-mCherry miaraka amin'ny marika proteinina fluorescent ireo dia namboarina tamin'ny alàlan'ny fomba mifototra amin'ny polymerase chain reaction (PCR) miaraka amin'ny plasmid pFA6a ho toy ny môdely (23). Ny karazana maneho Mid2-iRFP misy marika proteinina fluorescent eo ambany fifehezan'ny promoter GAL1 dia namboarina toy izao manaraka izao. Fanamafisana PCR ny filaharan'ny iRFP-KanMx avy amin'ny vector pKTiRFP-KAN (fanomezana an'i E. O'Shea, Addgene plasmid laharana 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; famantarana loharanon-karena fikarohana (RRID): Addgene_64687) Ary nampidirina tao amin'ny C-terminus an'ny Mid2 endogenous. Rehefa avy nohamafisina sy nakambana tao amin'ny promoter GAL1 ny filaharan'ny genome Mid2-iRFP, dia nampidirina tao amin'ny toerana Not I-Sac I an'ny plasmid fampidirana pRS306. Ny plasmid pRGS7 vokatr'izany dia nohafohezina tamin'ny Pst I mba hampidirina ao amin'ny toerana URA3.
Ny fototarazo Gas1-GFP fusion dia aseho eo ambany fifehezan'ny mpandrindra GAL1 ao amin'ny plasmid centromere (CEN), izay namboarina toy izao manaraka izao. Ny filaharan'ny Gas1-GFP dia nohamafisina tamin'ny PCR avy amin'ny plasmid pRS416-GAS1-GFP (24) (fanomezana an'i L. Popolo) ary natambatra tao amin'ny toerana Xma I–Xho I an'ny plasmid CEN pBEVY-GL LEU2 (fanomezana an'i C). Miller; Addgene plasmid laharana 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Ny plasmid vokatr'izany dia nomena anarana hoe pRGS6. Ny fototarazo Axl2-GFP fusion dia aseho ihany koa eo ambany fifehezan'ny mpandrindra GAL1 an'ny vector pBEVY-GL LEU2, ary toy izao manaraka izao ny firafiny. Nohamafisina avy amin'ny plasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) tamin'ny alalan'ny PCR ny filaharan'ny Axl2-GFP, ary natambatra tao amin'ny toerana Bam HI-Pst I an'ny vector pBEVY-GL LEU2. Ny plasmid vokatr'izany dia nomena anarana hoe pRGS12. Ny filaharan'ny oligonucleotides nampiasaina tamin'ity fandalinana ity dia voatanisa ao amin'ny Tabilao S2.
Nomena adenine 0.2% sy gliokaozy 2% [YP-dextrose (YPD)], proteinina p (YP) manankarena raffinose [YP-raffinose] 2% (YPR)] na galactose 2% [YP-galactose (YPG)] ho loharanon-karbônina, na tao anaty medium minimal sentetika (0.15% base azota leviora sy 0.5% ammonium sulfate) mba hanampiana asidra amine sy base ilaina amin'ny sakafo, ary misy gliokaozy 2% (medium minimal gliokaozy sentetika) na galactose 2% (medium minimal galactose sentetika) ho loharanon-karbônina.
Ho an'ny fakana sary mivantana, ireo sela mutant sec31-1 saro-pady amin'ny mari-pana izay maneho ny fananganana eo ambanin'ny mpandrindra GAL1 dia nobeazina tao amin'ny medium YPR tamin'ny 24°C nandritra ny alina ka hatramin'ny dingana afovoany log. Rehefa avy nampidirina tao amin'ny YPG tamin'ny 24°C nandritra ny adiny 1, dia notehirizina tao amin'ny SG tamin'ny 37°C nandritra ny 30 minitra ireo sela, ary avy eo dia nafindra tany amin'ny 24°C mba hivoaka avy amin'ny sakana famoahana. Nampiasaina ny Concanavalin A mba hametrahana ireo sela eo amin'ny fitaratra ary nalaina sary tamin'ny SCLIM. Ny SCLIM dia fitambaran'ny mikraoskaopy fluorescence mivadika Olympus IX-71 sy ny lantihy menaka misy lavaka nomerika UPlanSApo 100 × 1.4 (Olympus), scanner confocal kapila mihodina haingam-pandeha sy avo lenta (Yokogawa Electric), spektrometera namboarina manokana, ary fampangatsiahana namboarina manokana. Ny fanamafisana ny sary ao amin'ny rafitra (Hamamatsu Photonics) dia afaka manome rafitra lantihy manalehibe miaraka amin'ny fampitomboana farany × 266.7 sy fakantsary fitaovana mifamatotra amin'ny fiampangana izay mampitombo ny elektrôna (Hamamatsu Photonics) (21). Ny fakana sary dia tanterahan'ny rindrambaiko namboarina manokana (Yokogawa Electric). Ho an'ny sary 3D, nampiasa actuator piezoelectric namboarina manokana izahay mba hampihozongozona ny lantihy tanjona mitsangana, ary nanangona ny ampahany optika 100 nm ny elanelany tao anaty stack. Ny sary Z-stack dia avadika ho angon-drakitra voxel 3D, ary ny fiasa teorika momba ny fiparitahan'ny teboka ampiasaina amin'ny mikraoskaopy confocal kapila mihodina dia ampiasaina amin'ny fanodinana deconvolution amin'ny alàlan'ny rindrambaiko Volocity (PerkinElmer). Tamin'ny fampiasana ny rindrambaiko Volocity mba handrefesana ho azy ny famakafakana ny toerana iaraha-miasa, dia norefesina ny ERES anisan'izany ny entana. Ny famakafakana ny tsipika dia natao tamin'ny fampiasana ny rindrambaiko MetaMorph (Molecular Devices).
Ampiasao ny rindrambaiko GraphPad Prism mba hamaritana ny lanjan'ny statistika. Ho an'ny fitsapana t-Student roa-tailed sy ny fitsapana famakafakana ny variance mahazatra (ANOVA), ny fahasamihafana eo amin'ny vondrona dia heverina fa misy fiantraikany lehibe amin'ny P <0.05 (*).
Ho an'ny mikroskopia fluorescence an'ny Gas1-GFP, dia nobeazina nandritra ny alina tao amin'ny YPD ireo sela log phase ary nangonina tamin'ny alalan'ny centrifugation, nosasana indroa tamin'ny saline phosphate buffered, ary notehirizina tao anaty ranomandry nandritra ny 15 minitra farafahakeliny, ary avy eo dia nojerena teo ambanin'ny mikroskopia araka ny voalaza teo aloha (24). Ny mikroskopia Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) misy lens objective, sivana L5 (GFP), fakantsary Hamamatsu ary rindrambaiko Application Suite X (LAS X) no nampiasaina tamin'ny fahazoana.
Nohafohezina tamin'ny alalan'ny buffer santionany SDS tamin'ny 65°C nandritra ny 10 minitra ireo santionany, ary avy eo dia nosarahina tamin'ny alalan'ny electrophoresis gel SDS-polyacrylamide (PAGE). Ho an'ny fanadihadiana immunoblotting, dia nampidirina isaky ny lalana ny santionany 10 μl. Antikôra voalohany: Ampiasao ny polyclonal anti-Gas1 bitro amin'ny tahan'ny 1:3000, ny polyclonal anti-Emp24 bitro amin'ny tahan'ny 1:500, ary ny polyclonal anti-GFP bitro (fanomezana avy amin'i H. Riezman) amin'ny tahan'ny 1:3000. Ny antikôra monoclonal anti-Pgk1 totozy dia nampiasaina tamin'ny tahan'ny 1:5000 (fanomezana avy amin'i J. de la Cruz). Antikôra faharoa: Immunoglobulin G (IgG) osy conjugated peroxidase (HRP) ampiasaina amin'ny tahan'ny 1:3000 (Pierce). Nampiasaina tamin'ny tahan'ny 1:3000 (Pierce) ny HRP-conjugated goat anti-mouse IgG. Nojerena tamin'ny alalan'ny fomba chemiluminescence amin'ny alalan'ny reagent SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific) ny faritra misy ny hery fiarovana.
Araka ny voalaza ao amin'ny (31), dia nisy andrana immunoprecipitation voajanahary natao tamin'ny ampahany ER nohatsaraina. Raha fintinina, sasao indroa amin'ny buffer TNE [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride sy fangaro protease inhibitor) amin'ny 600 nm (OD600) amin'ny hakitroky optika 100 ny sela leviora. Nopotehina tamin'ny vakana fitaratra izy io, ary avy eo dia nesorina tamin'ny alalan'ny centrifugation ny poti-sela sy ny vakana fitaratra. Avy eo dia notifirina tamin'ny 17,000 g nandritra ny 15 minitra tamin'ny 4°C ny supernatant. Naverina natsipy tao amin'ny TNE ny pellet ary nampiana saponin digitalis hatramin'ny fifantohana farany 1%. Notehirizina nandritra ny 1 ora ny fampiatoana niaraka tamin'ny fihodinana tamin'ny 4°C, ary avy eo dia nesorina tamin'ny alalan'ny centrifugation tamin'ny 13,000 g tamin'ny 4°C nandritra ny 60 minitra ireo singa tsy mety levona. Ho an'ny immunoprecipitation Gas1-GFP, atsobohy mialoha amin'ny vakana agarose foana (ChromoTek) amin'ny 4°C mandritra ny adiny 1 ny santionany, ary avy eo atsobohy amin'ny GFP-Trap_A (ChromoTek) amin'ny 4°C mandritra ny adiny 3. Nosasana indimy tamin'ny TNE misy digoxigenin 0.2% ireo vakana immunoprecipitated, nodiovina tamin'ny buffer santionany SDS, nosarahina tamin'ny SDS-PAGE, ary nohadihadiana tamin'ny alalan'ny immunoblotting.
Araka ny voalaza ao amin'ny (31), ny famaritana ny fifandraisana amin'ny alalan'ny fampifandraisana dia natao tamin'ny ampahany ER nohatsaraina. Raha fintinina, ny ampahany ER nohatsaraina dia notehirizina tamin'ny dithiobis (succinimidyl propionate) 0.5 mM (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, Etazonia; 20°C, 20 min). Ny fihetsiky ny fifandraisana dia novonoina tamin'ny fanampiana glycine (fifantohana farany 50 mM, 5 minitra, 20°C).
Araka ny voalaza teo aloha (50), dia natao ny fanadihadiana MS momba ny ceramide amin'ny karazana wild-type sy GhLag1. Raha fintinina, dia nobeazina ho amin'ny dingana exponential (3 hatramin'ny 4 OD600 units/ml) ny sela tao amin'ny YPD tamin'ny 30°C, ary nojinjaina ny sela 25×107. Novonoina tamin'ny asidra trichloroacetic ny metabolismany. Ampiasao ny solvent extraction [ethanol, rano, ether, pyridine ary 4.2 N ammonium hydroxide (15:15:5:1:0.018 v/v)] ary 1.2 nmol ny internal standard C17 ceramide (860517, Avanti polar lipid) quality). Ampiasao ny monomethylamine reagent [methanol, rano, n-butanol ary methylamine solution (4:3:1:5 v/v)] mba hanaovana hydrolysis alkaline malefaka amin'ny extract, ary avy eo ampiasao ny n-butanol feno rano mba hanesorana ny sira. Farany, naverina natsipy tao anaty solvent mode positive [chloroform/methanol/rano (2:7:1) + 5 mM ammonium acetate] ny nalaina ary nampidirina tao amin'ny spectrometer mass. Natao ny fanaraha-maso ny fihetsika maro (MRM) mba hamantarana sy handrefesana ny molekiola sphingolipid. Ny spectrometer mass quadrupole tertiary TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) dia misy loharano ion nanoflow robotic Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) ho an'ny famakafakana lipida. Ny angovon'ny fifandonana dia nohatsaraina ho an'ny sokajy ceramide tsirairay. Ny angon-drakitra MS dia azo tamin'ny mode positive. Ho an'ny famerenana biolojika tsirairay, ny famantarana lipida dia ny mediana amin'ny fandrefesana telo tsy miankina.
Araka ny voalaza ao amin'ny (31), ireo sela (800 × 107) maneho ny Gas1-GFP dia nampiharana immunoprecipitation voajanahary. Ny Gas1-GFP voadio dia nosarahina tamin'ny SDS-PAGE ary nafindra tany amin'ny fonon'ny polyvinylidene fluoride (PVDF). Ny proteinina dia nojerena tamin'ny alàlan'ny fandokoana ny PVDF tamin'ny amide black. Ny tarika Gas1-GFP dia notapahina avy amin'ny PVDF ary nosasana in-5 tamin'ny methanol ary indray mandeha tamin'ny rano chromatography liquid-MS (LC-MS). Amin'ny alàlan'ny fampidirana ny fonon'ny fonon'ny membrane miaraka amin'ny 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), buffer ary 500μl 1 M sodium nitrite vao levona amin'ny 37°C mandritra ny 3 ora, ny ampahany lipida dia avoaka avy amin'ny Gas1-GFP ary lysis. Famotsorana inosine phosphate ceramide eo anelanelan'ny glucosamine sy inositol (51). Taorian'izay, nosasana inefatra tamin'ny rano LC-MS ny takelaka membrane, nohamainina tamin'ny mari-pana ao an-trano, ary notehirizina tao anaty atmosfera azota amin'ny -80°C mandra-pahatongan'ny fanadihadiana. Ho fanaraha-maso, santionany tsy misy fotony amin'ny takelaka PVDF no nampiasaina ho an'ny andrana tsirairay. Ny lipida nalaina avy amin'ny Gas1-GFP dia nohadihadiana tamin'ny MS araka ny voalaza (50). Raha fintinina, ireo takelaka PVDF misy GPI-lipid dia naverina natsipy tao anaty solvent lasitra 75μl ratsy [chloroform/methanol (1:2) + 5 mM ammonium acetate] ary nandalo ny electrospray ionization (ESI)-MRM/MS Analysis of sphingolipid species (TSQ Vantage). Amin'ity tranga ity, ny angon-drakitra MS dia azo tamin'ny fomba ion ratsy.
Araka ny voalaza tetsy aloha, ny ampahan'ny lipida amin'ny vatofantsika GPI dia nosarahina tamin'ny GPI-AP misy marika [3H]-inositol (16). Ny lipida dia nosarahina tamin'ny alalan'ny chromatography sosona manify mampiasa rafitra solvent (55:45:10 chloroform-methanol-0.25% KCl) ary nojerena tamin'ny alalan'ny FLA-7000 (Fujifilm).
Nosasana indroa tamin'ny buffer TNE miaraka amin'ny buffer TNE ireo sela maneho Gas1-GFP (600×107), ary novakivakina tamin'ny vakana fitaratra, ary avy eo dia nosentrifugasiona mba hanesorana ny poti-javatra sela sy ny vakana fitaratra. Avy eo dia nosentrifugasiona tamin'ny 17.000 g nandritra ny 1 ora tamin'ny 4°C ny supernatant. Nosasana tao amin'ny TNE ny pellet ary notehirizina tamin'ny 1 U PI-PLC (Invitrogen) tao amin'ny TNE misy saponin digitalis 0.2% nandritra ny 1 ora tamin'ny 37°C. Taorian'ny fitsaboana anzima, dia nesorina tamin'ny alalan'ny centrifugation tamin'ny 17.000 g tamin'ny 4°C nandritra ny 1 ora ny fonon'ny hoditra. Mba hahazoana ny Gas1-GFP amin'ny alalan'ny immunoprecipitate, dia notehirizina tamin'ny GFP-Trap_A (ChromoTek) tamin'ny 4°C nandritra ny alina ny supernatant. Ny Gas1-GFP voadio nosarahina tamin'ny SDS-PAGE dia nolokoina tamin'ny manga mamirapiratra Coomassie. Notapahina tamin'ny loko volondavenona manodidina ny lakandrano ny tarika fandokoana Gas1-GFP, ary avy eo rehefa avy nohamainina tamin'ny iodoacetamide sy nohamainina tamin'ny dithiothreitol, dia natao ny fandevonan-kanina tao anaty gel tamin'ny trypsin. Nalaina sy nohamainina ny peptides sy peptides tryptic maina tamin'ny GPI-glycans. Natsonika tao anaty rano 20 μl ny peptide maina. Ampidiro ampahany (8μl) ao amin'ny LC. Nampiasaina hanasarahana ny peptides amin'ny fepetra gradient manokana ny tsanganana octadecylsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; savaivony anatiny 150 mm × 1.0 mm; Nomura Chemical, Prefektioran'i Aichi, Japon). Ny dingana finday dia solvent A (0.08% asidra formika) sy solvent B (0.15% asidra formika amin'ny 80% acetonitrile). Nampiasaina ny rafitra Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) mba hanadiovana ny tsanganana amin'ny solvent A ao anatin'ny 55 minitra amin'ny tahan'ny fikorianan'ny 50 μl min-1 mandritra ny 5 minitra, ary avy eo dia nampitomboina ho 40% ny fifantohan'ny solvent B. (Etazonia). Nampidirina tsy an-kijanona tao amin'ny loharanon'ny ion ESI ny eluate, ary nohadihadiana tamin'ny LTQ Orbitrap XL (hybrid linear ion trap-orbitrap mass spectrometer; Thermo Fisher Scientific) ny peptides tryptic sy peptides misy GPI-glycans. Tao amin'ny fametrahana MS, napetraka ho 4.5 kV ny voltase avy amin'ny loharanon'ny kapilary, ary notazonina ho 300°C ny mari-pana avy amin'ny kapilary famindrana. Napetraka ho 15 V sy 50 V ny voltase avy amin'ny kapilary sy ny voltase avy amin'ny lens fantsona. Ny angon-drakitra MS dia azo tamin'ny fomba ion tsara (famahanana 60,000; fahamarinan'ny lanja 10 ampahany isaky ny tapitrisa) ao anatin'ny elanelan'ny lanja 300/m/z tahan'ny lanja/fiampangana (m/z) 3000. Ny angon-drakitra MS/MS dia azo tamin'ny alàlan'ny fandrika ion ao amin'ny LTQ Orbitrap XL [ireo isa 3 voalohany iankinan'ny angon-drakitra, dissociation vokatry ny fifandonana (CID)].
Natao tamin'ny alalan'ny rindrambaiko GROMACS (52) sy ny sehatry ny hery MARTINI 2 (53-55) ny simulation MD. Avy eo dia nampiasaina hanamboarana bilayer misy dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) sy Cer C18 na DOPC sy Cer C26 ny CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57). Ny topolojia sy ny koordinate an'ny Cer C26 dia avy amin'ny DXCE amin'ny fanesorana ireo vakana fanampiny amin'ny rambon'ny sphingosine. Ampiasao ny dingana voalaza etsy ambany mba handanjalanjana ny sosona roa ary hampandehanana azy, avy eo ampiasao ny koordinate farany amin'ny rafitra mba hanamboarana rafitra misy Emp24. Ny sehatra transmembrane an'ny leviora Emp24 (sisa 173 hatramin'ny 193) dia namboarina ho α-helix amin'ny fampiasana ny rafitra molekiolan'ny fitaovana MD (VMD) hita maso (58). Avy eo, rehefa avy nesorina ireo lipida mifanindry, dia nopotehina tamin'ny granules ny proteinina ary nampidirina tao amin'ny bilayer tamin'ny fampiasana CHARMM GUI. Ny rafitra farany dia misy DOPC 1202 sy Cer C26 302 na DOPC 1197 sy Cer C18 sy Emp24 295. Ampidiro ao anaty iônina ny rafitra hatramin'ny fifantohana 0.150M. Famerenana mahaleo tena efatra no natao ho an'ny firafitra roa sosona.
Ny lipid bilayer dia ampifandanjana amin'ny alàlan'ny dingana CHARMM GUI, izay misy ny fampihenana ary avy eo ny fandanjalanjana dingana 405,000, izay ahena tsikelikely sy foanana ny fameperana ny toerana, ary ampitomboina avy amin'ny 0.005 ps ho 0.02 ps ny dingana fotoana. Aorian'ny fandanjalanjana, dia mamokatra 6 µs miaraka amin'ny dingana fotoana 0.02 ps izy. Rehefa avy nampidirina ny Emp24, dia ampiasao ny dingana CHARMM GUI mitovy mba hampihenana sy hampifandanjana ny rafitra, ary avy eo dia ampiasaina mandritra ny 8 s mandritra ny famokarana.
Ho an'ny rafitra rehetra, mandritra ny dingana fandanjalanjana, ny tsindry dia fehezin'ny barostat Berendsen (59), ary mandritra ny dingana famokarana, ny tsindry dia fehezin'ny barostat Parrinello-Rahman (60). Amin'ny tranga rehetra, ny tsindry antonony dia 1 bar ary ampiasaina ny tetika fampifandraisana tsindry semi-isotropic. Amin'ny dingana fandanjalanjana sy famokarana, ny thermostat (61) miaraka amin'ny fanitsiana hafainganam-pandeha dia ampiasaina mba hampifandraisana ny mari-pana amin'ny proteinina, lipida ary poti-solvent tsirairay avy. Mandritra ny asa manontolo, ny mari-pana kendrena dia 310K. Ny fifandraisana tsy mifamatotra dia kajy amin'ny alàlan'ny famoronana lisitra fampiarahana mampiasa ny tetika Verlet miaraka amin'ny fandeferana buffer 0.005. Ny teny Coulomb dia kajy amin'ny alàlan'ny sehatry ny fihetsika sy ny elanelana fanapahana 1.1 nm. Ny teny Vander Waals dia mampiasa tetika fanapahana miaraka amin'ny elanelana fanapahana 1.1 nm, ary ny tetika fanapahana Verlet dia ampiasaina amin'ny mety ho fiovaovan'ny mari-pana (62).
Amin'ny fampiasana VMD, ny halavan'ny onjam-pandrefesana eo anelanelan'ny vakana phosphate DOPC na vakana ceramide AM1 sy ny proteinina dia 0.7 nm, ary kajy ny isan'ny lipida mifandray amin'ny proteinina. Araka ny raikipohy manaraka, kajy ny factor depletion-enrichment (DE) toy ny ao amin'ny (63): DE factor = (ny habetsaky ny lipida manontolo ao amin'ny proteinina 0.7) ao amin'ny proteinina 0.7 (ny habetsaky ny Cer ao amin'ny lipida manontolo)
Ny sanda voalaza dia azo amin'ny salan'isa, ary ny bara fahadisoana dia dika mitovy tsy miankina efatra amin'ny SE. Ny lanjan'ny antontan'isa an'ny anton-javatra DE dia kajy amin'ny alàlan'ny fitsapana t [(averageDE-factor-1)/SE]. Kajy ny sanda P avy amin'ny fizarana iray-tailed.
Nampiasaina hikajiana ny sarintany hakitroky 2D amin'ny lafiny misy ny Emp24 ao anatin'ny 250 ns farany amin'ny trace ny fitaovana GROMACS. Mba hahazoana ny sarintany fanatsarana/fandringanana ny ceramide, ny sarintany hakitroky ny Cer dia zaraina amin'ny fitambaran'ny sarintany Cer sy DOPC, ary avy eo zaraina amin'ny fifantohan'ny Cer ao amin'ny vatana. Ampiasaina ny mizana sarintany miloko mitovy.
Raha mila fitaovana fanampiny ho an'ity lahatsoratra ity dia jereo ny http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Lahatsoratra azon'ny rehetra idirana ity, zaraina araka ny fepetran'ny Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike, izay mamela ny fampiasana, fizarana ary famokarana amin'ny fitaovana rehetra, raha mbola tsy natao ho an'ny tombony ara-barotra ny fampiasana farany ary ny fototra iorenan'ny asa tany am-boalohany dia marina. Referansa.
Fanamarihana: Ny adiresy mailakao ihany no angatahinay aminao mba hahafantaran'ilay olona atolotrao ny pejy fa tianao ho hitany ilay mailaka ary tsy spam izany. Tsy haka adiresy mailaka izahay.
Ity fanontaniana ity dia ampiasaina hitsapana raha mpitsidika ianao ary hisorohana ny fandefasana spam mandeha ho azy.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Wagez -Linero (Sergio Lopez), Misaho Lopez (Sergio Lopez) Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Ny sary 3D avo lenta amin'ny fotoana tena izy dia mampiseho ny maha-zava-dehibe ny halavan'ny rojo ceramide ho an'ny fanasokajiana proteinina amin'ny toerana famokarana voafantina.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Wagez -Linero (Sergio Lopez), Misaho Lopez (Sergio Lopez) Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Ny sary 3D avo lenta amin'ny fotoana tena izy dia mampiseho ny maha-zava-dehibe ny halavan'ny rojo ceramide ho an'ny fanasokajiana proteinina amin'ny toerana famokarana voafantina.
©2020 American Association for the Advancement of Science. Zo rehetra voatokana. Ny AAAS dia mpiara-miasa amin'ny HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ary COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.