Efa nitatitra izahay teo aloha fa ambany kokoa ny tahan'ny asidra indole-3-propionic (IPA) metabolite tryptophan avy amin'ny tsinay ao amin'ny serum amin'ny marary voan'ny fibrosis aty. Ato amin'ity fandalinana ity, dia nodinihinay ny transcriptome sy ny methylome ADN ao amin'ny aty matavy loatra mifandraika amin'ny tahan'ny IPA serum, ary koa ny anjara asan'ny IPA amin'ny famporisihana ny tsy fiasan'ny sela stellate hepatic (HSCs) in vitro.
Nahitana marary matavy loatra miisa 116 tsy voan'ny diabeta karazany 2 (T2DM) (46.8 ± 9.3 taona; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m²) izay nandalo fandidiana bariatric tao amin'ny Foibe Fandidiana Bariatric Kuopio (KOBS) ny fanadihadiana. Norefesina tamin'ny alalan'ny chromatography liquid-mass spectrometry (LC-MS) ny haavon'ny IPA miparitaka, natao tamin'ny alalan'ny RNA sequencing manontolo ny fanadihadiana ny transcriptome-n'ny aty, ary natao tamin'ny alalan'ny Infinium HumanMethylation450 BeadChip ny fanadihadiana ny methylation ADN. Nampiasaina tamin'ny andrana in vitro ny sela stellate hepatic olombelona (LX-2).
Nifandray tamin'ny fanehoana ireo fototarazo tafiditra amin'ny lalan'ny apoptotic, mitophagic, ary longevity ao amin'ny aty ny haavon'ny IPA ao amin'ny serum. Ny fototarazo AKT serine/threonine kinase 1 (AKT1) no fototarazo mifandray betsaka indrindra sy manjaka indrindra ao amin'ny transcription ny aty sy ny mombamomba ny methylation ADN. Ny fitsaboana IPA dia niteraka apoptosis, fihenan'ny respiration mitochondrial, ary nanova ny morphology sela sy ny dinamikan'ny mitochondrial amin'ny alàlan'ny fanovana ny fanehoana ireo fototarazo fantatra fa mandrindra ny fibrosis, apoptosis, ary ny fahaveloman'ny sela LX-2.
Raha fintinina, ireo angon-drakitra ireo dia manohana fa ny IPA dia mety manana fiantraikany ara-pahasalamana ary afaka miteraka apoptosis ary manova ny endriky ny HSC ho amin'ny toetry ny tsy fiasana, ka manitatra ny mety hisian'ny fanakanana ny fibrosis amin'ny aty amin'ny alàlan'ny fanelingelenana ny fampandehanana ny HSC sy ny metabolisman'ny mitochondria.
Ny fihanaky ny hatavezana sy ny aretin'ny metabolika dia mifandray amin'ny fitomboan'ny tranganà aretin'ny aty matavy mifandraika amin'ny metabolika (MASLD); ity aretina ity dia misy fiantraikany amin'ny 25% ka hatramin'ny 30% amin'ny mponina amin'ny ankapobeny [1]. Ny voka-dratsin'ny MASLD dia ny fibrosis amin'ny aty, dingana mavitrika izay miavaka amin'ny fanangonan-karena mitohy amin'ny matrix fibrous extracellular (ECM) [2]. Ny sela lehibe tafiditra amin'ny fibrosis amin'ny aty dia ny sela stellate hepatic (HSC), izay mampiseho phenotypes efatra fantatra: quiescent, activated, inactivated, ary senescent [3, 4]. Ny HSCs dia azo ampiasaina ary miovaova avy amin'ny endrika quiescent ho sela fibroblast mivelatra miaraka amin'ny filàna angovo avo lenta, miaraka amin'ny fitomboan'ny fanehoana ny α-smooth muscle actin (α-SMA) sy ny collagen type I (Col-I) [5, 6]. Mandritra ny famerenana ny fibrosis amin'ny aty, ny HSCs mavitrika dia esorina amin'ny alàlan'ny apoptosis na inactivation. Ireo dingana ireo dia ahitana ny fihenan'ny fototarazo fibrogenika sy ny fanovana ny fototarazo prosurvival (toy ny lalan'ny famantarana NF-κB sy PI3K/Akt) [7, 8], ary koa ny fiovan'ny dinamika sy ny fiasan'ny mitochondria [9].
Hita fa nihena ny tahan'ny asidra indole-3-propionic metabolite tryptophan (IPA) ao amin'ny serum, izay vokarina ao amin'ny tsinay, amin'ny aretina metabolika olombelona anisan'izany ny MASLD [10–13]. Mifandray amin'ny fihinanana fibre ny IPA, fantatra amin'ny fiantraikany antioxidant sy anti-inflammatoire, ary mampihena ny phenotype steatohepatitis tsy misy alikaola (NASH) vokatry ny sakafo in vivo sy in vitro [11–14]. Misy porofo avy amin'ny fanadihadiana teo aloha nataonay, izay naneho fa ambany kokoa ny tahan'ny IPA ao amin'ny serum amin'ny marary voan'ny fibrosis aty noho ny amin'ny marary matavy loatra tsy misy fibrosis aty ao amin'ny Kuopio Bariatric Surgery Study (KOBS). Ankoatra izany, nasehonay fa ny fitsaboana IPA dia mety hampihena ny fanehoana ny gène izay marika mahazatra amin'ny adhesion sela, ny fifindran'ny sela ary ny fampahavitrihana ny sela fototra hematopoietic ao amin'ny modely sela stellate hepatic olombelona (LX-2) ary mety ho metabolite hepatoprotective [15]. Na izany aza, mbola tsy mazava ny fomba ahafahan'ny IPA miteraka ny fihenan'ny fibrosis aty amin'ny alàlan'ny fampahavitrihana ny apoptosis HSC sy ny bioenergetics mitochondrial.
Eto izahay dia mampiseho fa ny IPA ao amin'ny serum dia mifandray amin'ny fanehoana ireo fototarazo manankarena amin'ny apoptosis, mitophagy, ary ny lalan'ny faharetana ao amin'ny atin'ny olona matavy loatra nefa tsy voan'ny diabeta karazany 2 (KOBS). Ankoatra izany, hitanay fa ny IPA dia afaka mandrisika ny fanadiovana sy ny fahasimban'ny sela fototra hematopoietic (HSC) miasa amin'ny alàlan'ny lalan'ny inactivation. Ireo valiny ireo dia mampiseho anjara toerana vaovao ho an'ny IPA, ka mahatonga azy io ho lasibatra fitsaboana mety hampiroborobo ny fihenan'ny fibrosis amin'ny aty.
Nisy fanadihadiana teo aloha tao amin'ny vondrona KOBS naneho fa ambany kokoa ny tahan'ny IPA ao amin'ny ra ho an'ny marary voan'ny fibrosis aty raha oharina amin'ny marary tsy manana fibrosis aty [15]. Mba hanilihana ny mety ho fiantraikan'ny diabeta karazany 2, dia naka marary matavy loatra miisa 116 tsy manana diabeta karazany 2 izahay (salan-taona ± SD: 46.8 ± 9.3 taona; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (Tabilao 1) avy amin'ny fanadihadiana KOBS mitohy amin'ny maha-mponina ao amin'ny fanadihadiana azy [16]. Nanome fanekena an-tsoratra sy am-pahalalana ireo mpandray anjara rehetra ary neken'ny Komitin'ny Etika ao amin'ny Hopitaly North Savo County ny protocole fanadihadiana mifanaraka amin'ny Fanambarana Helsinki (54/2005, 104/2008 ary 27/2010).
Nalaina nandritra ny fandidiana bariatric ny santionan'ny biopsy aty ary nojeren'ireo mpitsabo za-draharaha tamin'ny alalan'ny histolojia araka ny fepetra voalaza teo aloha [17, 18]. Voafintina ao amin'ny Tabilao Fanampiny S1 ireo fepetra fanombanana ary efa voalaza teo aloha [19].
Nohadihadiana tamin'ny alalan'ny "untargeted liquid chromatography-mass spectrometry" (LC-MS) ho an'ny fanadihadiana metabolomika (n = 116) ireo santionan'ny serum tsy nifady hanina. Nohadihadiana tamin'ny alalan'ny rafitra UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Alemaina) araka ny voalaza teo aloha19 ireo santionany. Ny famantarana ny alikaola isopropyl (IPA) dia nifototra tamin'ny fotoana fihazonana sy ny fampitahana ny spektrum MS/MS amin'ny fenitra madio. Ny hamafin'ny famantarana IPA (faritra faratampony) dia nodinihina tamin'ny fanadihadiana fanampiny rehetra [20].
Natao tamin'ny fampiasana Illumina HiSeq 2500 ny fandaharana ARN manontolo amin'ny aty ary nokarakaraina mialoha ny angon-drakitra araka ny voalaza teo aloha [19, 21, 22]. Nanao fanadihadiana momba ny fanehoana samihafa nokendrena tamin'ny alalan'ny kendrena ny transcripts izay misy fiantraikany amin'ny fiasan'ny mitochondrial/biogenesis izahay tamin'ny fampiasana gène 1957 nofantenana avy amin'ny tahiry MitoMiner 4.0 [23]. Natao tamin'ny fampiasana Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, Etazonia) ny fanadihadiana ny methylation ADN amin'ny aty tamin'ny fampiasana fomba fiasa mitovy amin'ny voalaza teo aloha [24, 25].
Nomen'ny Profesora Stefano Romeo tamim-pitiavana ireo sela kintana ao amin'ny aty olombelona (LX-2) ary novolena sy notehirizina tao anaty medium DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Mba hisafidianana ny fatra miasa amin'ny IPA, dia notsaboina tamin'ny fifantohana IPA samihafa (10 μM, 100 μM ary 1 mM; Sigma, 220027) tao anaty medium DMEM/F12 nandritra ny 24 ora ireo sela LX-2. Ankoatra izany, mba handinihana ny fahafahan'ny IPA manafoana ny HSC, dia notsaboina niaraka tamin'ny 5 ng/ml TGF-β1 (rafitra R&D, 240-B-002/CF) sy 1 mM IPA tao anaty medium tsy misy serum nandritra ny 24 ora ireo sela LX-2. Ho an'ireo fanaraha-maso mifandraika amin'izany, ny HCL 4 nM misy BSA 0.1% dia nampiasaina tamin'ny fitsaboana TGF-β1 ary DMSO 0.05% no nampiasaina tamin'ny fitsaboana IPA, ary samy nampiasaina niaraka ho an'ny fitsaboana mitambatra izy roa.
Nodinihina tamin'ny alalan'ny FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit miaraka amin'ny 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, Etazonia, Cat# 640922) ny apoptosis araka ny toromariky ny mpanamboatra. Raha fintinina, ny LX-2 (1 × 105 sela/lavadrano) dia novolena nandritra ny alina tao anaty takelaka misy lavadrano 12 ary avy eo dia notsaboina tamin'ny fatra IPA na IPA sy TGF-β1 imbetsaka. Ny ampitson'iny, ireo sela mitsingevana sy miraikitra dia nangonina, nodiovina tamin'ny tripsin, nosasana tamin'ny PBS, naverina natsipy tao amin'ny Annexin V binding buffer, ary notehirizina tamin'ny FITC-Annexin V sy 7-AAD nandritra ny 15 minitra.
Nolokoina ny mitochondria tao amin'ny sela velona mba hahitana ny asa oksidativa amin'ny fampiasana ny Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Ho an'ny fanadihadiana MTR, dia novolena tamin'ny hakitroky mitovy amin'ny IPA sy TGF-β1 ny sela LX-2. Rehefa afaka 24 ora, dia nodiovina tamin'ny trypsin ny sela velona, ​​nosasana tamin'ny PBS, ary avy eo dia novolena tamin'ny 100 μM MTR tao anaty rano tsy misy serum tamin'ny 37 °C nandritra ny 20 minitra araka ny voalaza teo aloha [26]. Ho an'ny fanadihadiana ny morphology sela velona, ​​dia nohadihadiana ny haben'ny sela sy ny fahasarotan'ny cytoplasmika tamin'ny fampiasana ny masontsivana forward scatter (FSC) sy side scatter (SSC).
Ny angon-drakitra rehetra (hetsika 30.000) dia nalaina tamin'ny fampiasana ny NovoCyte Quanteon (Agilent) ary nohadihadiana tamin'ny fampiasana ny rindrambaiko NovoExpress® 1.4.1 na FlowJo V.10.
Ny tahan'ny fanjifana oksizenina (OCR) sy ny tahan'ny asidra ivelany (ECAR) dia norefesina mivantana tamin'ny fampiasana Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) izay misy Seahorse XF Cell Mito Stress araka ny torolalan'ny mpanamboatra. Raha fintinina, sela LX-2 2 × 104/lavadrano no nafafy teo amin'ny takelaka fambolena sela XF96. Rehefa avy notehirizina nandritra ny alina, dia notsaboina tamin'ny isopropanol (IPA) sy TGF-β1 (Fomba Fanampiny 1) ny sela. Natao tamin'ny fampiasana rindrambaiko Seahorse XF Wave ny famakafakana angon-drakitra, izay ahitana ny Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator. Avy amin'izany no nikajiana ny Bioenergetic Health Index (BHI) [27].
Nadika ho cDNA ny ARN manontolo. Jereo ny referansa [15] raha mila fomba manokana. Nampiasaina ho fanaraha-maso ny fototarazo ny haavon'ny proteinina asidra ribosomal 60S P0 (RPLP0) sy ny cyclophilin A1 (PPIA). Nampiasaina niaraka tamin'ny TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) na ny Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) ny haavon'ny fanehoana ny fototarazo, ary nokajiana tamin'ny fampiasana ny masontsivana fampitahana ny sandan'ny Ct (ΔΔCt) sy ny fomba ∆∆Ct ny antsipirian'ny primer. Omena ao amin'ny Tabilao Fanampiny S2 sy S3 ny antsipirian'ny primer.
Ny ADN nokleary (ncDNA) sy ny ADN mitochondrial (mtDNA) dia nalaina tamin'ny fampiasana ny kitapo ra sy sela DNeasy (Qiagen) araka ny voalaza teo aloha [28]. Ny habetsaky ny mtDNA dia nokajiana tamin'ny fikajiana ny tahan'ny faritra mtDNA kendrena tsirairay amin'ny salan'isa jeometrika amin'ny faritra ADN nokleary telo (mtDNA/ncDNA), araka ny voalaza ao amin'ny Fomba Fanampiny 2. Ny antsipirian'ny primers ho an'ny mtDNA sy ncDNA dia omena ao amin'ny Tabilao Fanampiny S4.
Nolokoina tamin'ny Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) ireo sela velona mba hijerena ireo tambajotra mitochondria intercellular sy intracellular. Nambolena tamin'ny fitaratra tao anaty takelaka fambolena misy fanambanin'ny fitaratra mifanaraka aminy (Ibidi GmbH, Martinsried, Alemaina) ireo sela LX-2 (1 × 104 sela/lavadrano). Rehefa afaka 24 ora, dia notehirizina tamin'ny MTR 100 μM nandritra ny 20 minitra tamin'ny 37 °C ireo sela LX-2 velona ary nolokoina tamin'ny DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) ny ati-sela araka ny voalaza teo aloha [29]. Nojerena ireo tambajotra mitochondria tamin'ny fampiasana mikroskopia Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Alemaina) izay misy môdioly confocal Zeiss LSM 800 amin'ny 37 °C ao anaty atmosfera mando miaraka amin'ny CO2 5% amin'ny fampiasana tanjona 63 × NA 1.3. Nahazo sary Z-series folo ho an'ny karazana santionany tsirairay izahay. Ny andiany Z tsirairay dia misy fizarana 30, samy manana hatevina 9.86 μm avy. Ho an'ny santionany tsirairay, sary avy amin'ny sehatra fijery folo samihafa no nalaina tamin'ny alàlan'ny rindrambaiko ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Alemaina), ary ny fanadihadiana ny morphology mitochondrial dia natao tamin'ny alàlan'ny rindrambaiko ImageJ (v1.54d) [30, 31] araka ny masontsivana voalaza amin'ny antsipiriany ao amin'ny Fomba Fanampiny 3.
Nohamafisina tamin'ny glutaraldehyde 2% tao anaty phosphate buffer 0.1 M ireo sela, narahin'ny fanamafisana tamin'ny vahaolana osmium tetroxide 1% (Sigma Aldrich, MO, Etazonia), nohamainina tsikelikely tamin'ny acetone (Merck, Darmstadt, Alemaina), ary farany dia natsofoka tao anaty epoxy resin. Nomanina sy nolokoina tamin'ny uranyl acetate 1% (Merck, Darmstadt, Alemaina) sy 1% lead citrate (Merck, Darmstadt, Alemaina) ireo fizarana manify dia manify. Azo tamin'ny alalan'ny mikroskopia elektrôna fandefasana JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokyo, Japon) tamin'ny voltazy mihafaingana 80 kV ny sary ultrastructure.
Nohadihadiana tamin'ny alalan'ny mikroskopia phase-contrast tamin'ny fampitomboana 50x ny endriky ny sela LX-2 notsaboina tamin'ny IPA nandritra ny 24 ora, tamin'ny alalan'ny mikroskopia hazavana Zeiss inverted (Zeiss Axio Vert.A1 sy AxioCam MRm, Jena, Alemaina).
Ny angon-drakitra ara-pitsaboana dia naseho ho toy ny salan'isa ± fivilian-dàlana mahazatra na mediana (elanelan'ny interquartile: IQR). Ny famakafakana ny fiovaovana tokana (fiovaovana mitohy) na ny fitsapana χ² (fiovaovana sokajy) dia nampiasaina mba hampitahana ny fahasamihafana eo amin'ireo vondrona fianarana telo. Ny tahan'ny diso tsara (FDR) dia nampiasaina hanitsiana ny fitsapana maromaro, ary ny fototarazo manana FDR < 0.05 dia noheverina ho manan-danja ara-statistika. Ny famakafakana ny fifandraisan'ny Spearman dia nampiasaina mba hampifandray ny methylation ADN CpG amin'ny hamafin'ny famantarana IPA, miaraka amin'ny sanda p nominal (p < 0.05) voalaza.
Natao tamin'ny alalan'ny fitaovana famakafakana andiana fototarazo miorina amin'ny tranonkala (WebGestalt) ny famakafakana ny lalan-kizorana ho an'ny dika mitovy miisa 268 (nominal p < 0.01), dika mitovy miisa 119 mifandraika amin'ny mitochondria (nominal p < 0.05), ary CpG miisa 4350 avy amin'ny dika mitovy miisa 3093 mifandraika amin'ny haavon'ny IPA ao amin'ny serum. Nampiasaina mba hitadiavana fototarazo mifanindry ny fitaovana Venny DB (version 2.1.0) azo alaina maimaim-poana, ary ny StringDB (version 11.5) no nampiasaina mba hijerena ny fifandraisan'ny proteinina sy proteinina.
Ho an'ny andrana LX-2, notsapaina ny ara-dalàna ny santionany tamin'ny fampiasana ny fitsapana D'Agostino-Pearson. Nalaina avy amin'ny famerenana biolojika telo farafahakeliny ny angon-drakitra ary nosedraina tamin'ny ANOVA tokana miaraka amin'ny fitsapana Bonferroni post hoc. Ny sandan'ny p latsaky ny 0.05 dia noheverina ho manan-danja ara-statistika. Aseho amin'ny salan'isa ± SD ny angon-drakitra, ary aseho amin'ny sary tsirairay ny isan'ny andrana. Ny fanadihadiana sy ny grafika rehetra dia natao tamin'ny fampiasana rindrambaiko statistika GraphPad Prism 8 ho an'ny Windows (GraphPad Software Inc., version 8.4.3, San Diego, Etazonia).
Voalohany, nodinihinay ny fifandraisan'ny haavon'ny IPA serum amin'ny transcripts amin'ny aty, ny vatana manontolo, ary ny mitochondria. Tao amin'ny mombamomba ny transcript manontolo, ny gène matanjaka indrindra mifandraika amin'ny haavon'ny IPA serum dia MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 3); ao amin'ny mombamomba ny transcript mifandraika amin'ny mitochondria, ny gène matanjaka indrindra mifandraika amin'izany dia AKT1 (FDR = 0.7621; AKT serine/threonine kinase 1) (Rakitra fanampiny 1 sy rakitra fanampiny 2).
Avy eo dia nodinihinay ny dika mitovy manerantany (n = 268; p < 0.01) sy ny dika mitovy mifandraika amin'ny mitochondria (n = 119; p < 0.05), ary tamin'ny farany dia fantatray fa ny apoptosis no lalana kanonika manan-danja indrindra (p = 0.0089). Ho an'ny dika mitovy mitochondria mifandraika amin'ny haavon'ny IPA ao amin'ny serum, dia nifantoka tamin'ny apoptosis (FDR = 0.00001), mitophagy (FDR = 0.00029), ary ny lalan'ny famantarana TNF (FDR = 0.000006) izahay (Sary 1A, Tabilao 2, ary Sary Fanampiny 1A-B).
Fanadihadiana mifanindry momba ny transcripts manerantany, mifandraika amin'ny mitochondria, ary ny methylation ADN ao amin'ny atin'olombelona mifandraika amin'ny haavon'ny IPA serum. Ny A dia maneho transcripts manerantany 268, transcripts mifandraika amin'ny mitochondria 119, ary transcripts ADN methylated izay aseho amin'ny toerana CpG 3092 mifandraika amin'ny haavon'ny IPA serum (p values ​​​​< 0.01 ho an'ny transcripts manerantany sy ADN methylated, ary p values ​​​​< 0.05 ho an'ny transcripts mitochondrial). Ny transcripts lehibe mifanindry dia aseho eo afovoany (AKT1 sy YKT6). B Ny sarintany fifandraisan'ny gène 13 manana isa fifandraisana ambony indrindra (0.900) amin'ny gène hafa dia namboarina avy amin'ny gène mifanindry 56 (faritra tsipika mainty) izay mifandray betsaka amin'ny haavon'ny IPA serum amin'ny fampiasana ny fitaovana an-tserasera StringDB. Maitso: Gène aseho amin'ny singa sela Gene Ontology (GO): mitochondria (GO:0005739). AKT1 no proteinina manana isa ambony indrindra (0.900) ho an'ny fifandraisana amin'ny proteinina hafa mifototra amin'ny angon-drakitra (mifototra amin'ny fitrandrahana lahatsoratra, andrana, tahiry, ary fiaraha-miasa). Ny fotony tambajotra dia maneho ny proteinina, ary ny sisiny kosa maneho ny fifandraisana misy eo amin'ny proteinina.
Koa satria afaka mandrindra ny firafitry ny epigenetika amin'ny alàlan'ny methylation ADN [32] ny metabolites microbiota ao amin'ny tsinay, dia nodinihinay raha mifandray amin'ny methylation ADN amin'ny aty ny haavon'ny IPA ao amin'ny serum. Hitanay fa ny toerana methylation roa lehibe mifandraika amin'ny haavon'ny IPA ao amin'ny serum dia akaikin'ny faritra manankarena proline-serine 3 (C19orf55) sy ny fianakaviana proteinina heat shock B (kely) mpikambana 6 (HSPB6) (Rakitra fanampiny 3). Ny methylation ADN an'ny 4350 CpG (p < 0.01) dia mifandray amin'ny haavon'ny IPA ao amin'ny serum ary nanankarena tamin'ny lalan-kery mifehy ny faharetan'ny fiainana (p = 0.006) (Sary 1A, Tabilao 2, ary Sary fanampiny 1C).
Mba hahatakarana ireo mekanisma biolojika fototry ny fifandraisana misy eo amin'ny haavon'ny IPA ao amin'ny serum, ny transcripts manerantany, ny transcripts mifandraika amin'ny mitochondria, ary ny methylation ADN ao amin'ny atin'olombelona, ​​dia nanao fanadihadiana momba ny fifandimbiasan'ireo gène voafaritra tao amin'ny fanadihadiana ny lalana teo aloha izahay (Sary 1A). Ny vokatry ny fanadihadiana momba ny fanatsarana ny lalana amin'ireo gène mifanindry 56 (ao anatin'ny tsipika mainty ao amin'ny Sary 1A) dia naneho fa ny lalan'ny apoptosis (p = 0.00029) dia nanasongadina gène roa iraisana amin'ireo fanadihadiana telo: AKT1 sy YKT6 (YKT6 v-SNARE homolog), araka ny aseho amin'ny kisarisary Venn (Sary Fanampiny 2 sy Sary 1A). Mahaliana fa hitanay fa ny AKT1 (cg19831386) sy YKT6 (cg24161647) dia mifandray tsara amin'ny haavon'ny IPA ao amin'ny serum (Rakitra Fanampiny 3). Mba hamantarana ny mety ho fifandraisan'ny proteinina eo amin'ireo vokatra gène, dia nifidy gène 13 manana isa faritra iraisana ambony indrindra (0.900) amin'ireo gène mifanindry 56 ho toy ny fidirana izahay ary nanangana sarintany fifandraisana. Araka ny haavon'ny fahatokisana (fahatokisana marginal), ny fototarazo AKT1 manana isa ambony indrindra (0.900) no teo an-tampony (Sary 1B).
Mifototra amin'ny fanadihadiana ny lalan-kizorana, hitanay fa ny apoptosis no lalan-kizorana lehibe indrindra, ka nodinihinay raha toa ka hisy fiantraikany amin'ny apoptosis an'ny HSCs in vitro ny fitsaboana IPA. Nasehonay teo aloha fa tsy misy poizina ho an'ny sela LX-2 ny fatra samihafa amin'ny IPA (10 μM, 100 μM, ary 1 mM) [15]. Nasehon'ity fanadihadiana ity fa ny fitsaboana IPA amin'ny 10 μM sy 100 μM dia nampitombo ny isan'ny sela velona sy maty. Na izany aza, raha ampitahaina amin'ny vondrona fanaraha-maso, nihena ny fahaveloman'ny sela tamin'ny fifantohana IPA 1 mM, raha tsy niova kosa ny tahan'ny maty (Sary 2A, B). Manaraka izany, mba hahitana ny fifantohana tsara indrindra hamporisihana ny apoptosis amin'ny sela LX-2, dia notsapainay nandritra ny 24 ora ny 10 μM, 100 μM, ary 1 mM IPA (Sary 2A-E sy Sary Fanampiny 3A-B). Mahaliana fa ny IPA 10 μM sy 100 μM dia nampihena ny tahan'ny apoptosis (%), na izany aza, ny IPA 1 mM dia nampitombo ny tahan'ny apoptosis tara sy ny apoptosis (%) raha oharina amin'ny fanaraha-maso ary noho izany dia nofidina ho an'ny fanandramana fanampiny (Sary 2A–D).
Ny IPA dia miteraka apoptosis an'ny sela LX-2. Ny fomba fandokoana roa sosona Annexin V sy 7-AAD dia nampiasaina mba handrefesana ny tahan'ny apoptotic sy ny morphology sela amin'ny alàlan'ny flow cytometry. Ny sela BA dia novolena tamin'ny 10 μM, 100 μM ary 1 mM IPA nandritra ny 24 ora na tamin'ny F–H TGF-β1 (5 ng/ml) sy 1 mM IPA tao anaty medium tsy misy serum nandritra ny 24 ora. A: sela velona (Annexin V -/ 7AAD-); B: sela necrotic (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: aloha (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: tara (Annexin V+/7AAD.+); E, H: isan-jaton'ny sela apoptotic aloha sy tara amin'ny tahan'ny apoptotic (%). Ny angon-drakitra dia aseho ho salan'isa ± SD, n = 3 fanandramana mahaleo tena. Ny fampitahana statistika dia natao tamin'ny fampiasana ANOVA tokana miaraka amin'ny fitsapana Bonferroni post hoc. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Araka ny efa nasehontsika teo aloha, ny 5 ng/ml TGF-β1 dia afaka mandrisika ny fampahavitrihana ny HSC amin'ny alàlan'ny fampitomboana ny fanehoana ireo fototarazo marika mahazatra [15]. Ny sela LX-2 dia notsaboina tamin'ny 5 ng/ml TGF-β1 sy 1 mM IPA miaraka (Sary 2E–H). Ny fitsaboana TGF-β1 dia tsy nanova ny tahan'ny apoptosis, na izany aza, ny fitsaboana miaraka amin'ny IPA dia nampitombo ny tahan'ny apoptosis tara sy ny tahan'ny apoptosis (%) raha oharina amin'ny fitsaboana TGF-β1 (Sary 2E–H). Ireo valiny ireo dia manondro fa ny 1 mM IPA dia afaka mampiroborobo ny apoptosis ao amin'ny sela LX-2 tsy miankina amin'ny induction TGF-β1.
Nodinihinay bebe kokoa ny fiantraikan'ny IPA amin'ny respiration mitochondrial ao amin'ny sela LX-2. Ny valiny dia naneho fa ny 1 mM IPA dia nampihena ny masontsivana momba ny tahan'ny fanjifana oksizenina (OCR): respiration tsy mitochondria, respiration fototra sy ambony indrindra, fivoahan'ny proton ary famokarana ATP raha oharina amin'ny vondrona fanaraha-maso (Sary 3A, B), raha toa kosa ka tsy niova ny bioenergetic health index (BHI).
Mampihena ny respiration mitochondrial ao amin'ny sela LX-2 ny IPA. Ny fiolahana respiration mitochondrial (OCR) dia aseho amin'ny alalan'ny paramètres respiration mitochondrial (respiration tsy mitochondrial, respiration basal, respiration ambony indrindra, fivoahan'ny proton, famokarana ATP, SRC ary BHI). Ny sela A sy B dia novolena tamin'ny 10 μM, 100 μM ary 1 mM IPA nandritra ny 24 ora tsirairay avy. Ny sela C sy D dia novolena tamin'ny TGF-β1 (5 ng/ml) sy 1 mM IPA tao anaty medium tsy misy serum nandritra ny 24 ora tsirairay avy. Ny fandrefesana rehetra dia naverina tamin'ny laoniny araka ny votoatin'ny ADN tamin'ny fampiasana ny kitapo CyQuant. BHI: index bioenergetic health; SRC: fahafahan'ny respiration reserve; OCR: tahan'ny fanjifana oksizenina. Ny angon-drakitra dia aseho amin'ny alalan'ny salan'isa ± standard deviation (SD), n = 5 fanandramana tsy miankina. Ny fampitahana statistika dia natao tamin'ny alalan'ny ANOVA tokana sy ny fitsapana Bonferroni post hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; ary ***p < 0.001
Mba hahazoana fahatakarana feno kokoa momba ny fiantraikan'ny IPA amin'ny mombamomba ny bioenergetika an'ny sela LX-2 miasa amin'ny TGF-β1, dia nodinihinay ny phosphorylation oxidative mitochondrial tamin'ny alàlan'ny OCR (Sary 3C, D). Ny valiny dia naneho fa ny fitsaboana TGF-β1 dia afaka mampihena ny respiration ambony indrindra, ny fahafahan'ny respiration reserve (SRC) ary ny BHI raha oharina amin'ny vondrona fanaraha-maso (Sary 3C, D). Ho fanampin'izany, ny fitsaboana mitambatra dia nampihena ny respiration basal, ny fivoahan'ny proton ary ny famokarana ATP, saingy ny SRC sy BHI dia ambony lavitra noho ireo notsaboina tamin'ny TGF-β1 (Sary 3C, D).
Nanao ny "Cellular Energy Phenotype Test" izay nomen'ny rindrambaiko Seahorse (Sary Fanampiny 4A–D) ihany koa izahay. Araka ny aseho amin'ny Sary Fanampiny 3B, samy nihena ny mety ho vitan'ny metabolisma OCR sy ECAR taorian'ny fitsaboana TGF-β1, na izany aza, tsy nisy fahasamihafana hita teo amin'ny vondrona fitsaboana mitambatra sy IPA raha oharina amin'ny vondrona fanaraha-maso. Ankoatra izany, samy nihena ny haavon'ny OCR fototra sy ny adin-tsaina taorian'ny fitsaboana mitambatra sy IPA raha oharina amin'ny vondrona fanaraha-maso (Sary Fanampiny 4C). Mahaliana fa nisy lamina mitovy amin'izany hita tamin'ny fitsaboana mitambatra, izay tsy nahitana fiovana teo amin'ny haavon'ny ECAR fototra sy adin-tsaina raha oharina amin'ny fitsaboana TGF-β1 (Sary Fanampiny 4C). Ao amin'ny HSC, ny fihenan'ny phosphorylation oxidative mitochondrial sy ny fahafahan'ny fitsaboana mitambatra mamerina ny SCR sy BHI aorian'ny fitsaboana TGF-β1 dia tsy nanova ny mety ho vitan'ny metabolisma (OCR sy ECAR). Raha fintinina, ireo valiny ireo dia manondro fa ny IPA dia mety hampihena ny bioenergetics ao amin'ny HSC, izay manondro fa ny IPA dia mety hiteraka profil angovo ambany kokoa izay manova ny phenotype HSC mankany amin'ny tsy fiasana (Sary Fanampiny 4D).
Nodinihina ny fiantraikan'ny IPA amin'ny dinamikan'ny mitochondria tamin'ny fampiasana fandrefesana telo dimensions ny morphology sy ny fifandraisan'ny tambajotra mitochondria ary koa ny fandokoana MTR (Sary 4 sy Sary Fanampiny 5). Ny Sary 4 dia mampiseho fa, raha ampitahaina amin'ny vondrona fanaraha-maso, ny fitsaboana TGF-β1 dia nampihena ny velaran-tany antonony, ny isan'ny sampana, ny halavan'ny sampana manontolo, ary ny isan'ny fifandraisan'ny sampana (Sary 4A sy B) ary nanova ny ampahany amin'ny mitochondria avy amin'ny morphology boribory mankany amin'ny morphology antonony (Sary 4C). Ny fitsaboana IPA ihany no nampihena ny haben'ny mitochondria antonony ary nanova ny ampahany amin'ny mitochondria avy amin'ny morphology boribory mankany amin'ny morphology antonony raha oharina amin'ny vondrona fanaraha-maso (Sary 4A). Mifanohitra amin'izany kosa, ny sphericity, ny halavan'ny sampana antonony, ary ny asan'ny mitochondria izay notombanan'ny MTR miankina amin'ny mety ho vitan'ny membrane mitochondria (Sary 4A sy E) dia tsy niova ary ireo masontsivana ireo dia tsy nisy fahasamihafana teo amin'ireo vondrona. Raha fintinina, ireo valiny ireo dia manondro fa ny fitsaboana TGF-β1 sy IPA dia toa manova ny endrika sy ny haben'ny mitochondria ary koa ny fahasarotan'ny tambajotra ao amin'ny sela LX-2 velona.
Manova ny dinamikan'ny mitochondria sy ny habetsahan'ny ADN mitochondria ao amin'ny sela LX-2 ny IPA. A. Sary confocal maneho ny sela LX-2 velona novolena tamin'ny TGF-β1 (5 ng/ml) sy 1 mM IPA nandritra ny 24 ora tao anaty medium tsy misy serum izay mampiseho tambajotra mitochondria nolokoina tamin'ny Mitotracker™ Red CMXRos sy ny nokleary nolokoina manga tamin'ny DAPI. Ny angon-drakitra rehetra dia nahitana sary 15 farafahakeliny isaky ny vondrona. Nahazo sary Z-stack 10 ho an'ny karazana santionany tsirairay izahay. Ny filaharan'ny axe Z tsirairay dia nahitana silaka 30, samy manana hatevina 9.86 μm avy. Bara mizana: 10 μm. B. Zavatra maneho (mitochondria ihany) fantatra amin'ny alàlan'ny fampiharana ny adaptive thresholding amin'ny sary. Natao ho an'ny sela rehetra ao amin'ny vondrona tsirairay ny fanadihadiana sy ny fampitahana ny fifandraisana ara-morfolojikan'ny tambajotra mitochondria. C. Fahita matetika ny tahan'ny endrika mitochondria. Ny sanda akaikin'ny 0 dia manondro endrika boribory, ary ny sanda akaikin'ny 1 dia manondro endrika kofehy. D Ny votoatin'ny ADN Mitochondria (mtDNA) dia voafaritra araka ny voalaza ao amin'ny Fitaovana sy Fomba. Ny fanadihadiana E Mitotracker™ Red CMXRos dia natao tamin'ny alalan'ny flow cytometry (hetsika 30.000) araka ny voalaza ao amin'ny Materials and Methods. Aseho amin'ny salan'isa ± SD, n = 3 andrana tsy miankina ny angon-drakitra. Ny fampitahana statistika dia natao tamin'ny alalan'ny fampiasana ANOVA tokana sy fitsapana Bonferroni post hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Avy eo dia nodinihinay ny votoatin'ny mtDNA ao amin'ny sela LX-2 ho mariky ny isan'ny mitochondria. Raha ampitahaina amin'ny vondrona fanaraha-maso, nitombo ny votoatin'ny mtDNA tao amin'ny vondrona notsaboina tamin'ny TGF-β1 (Sary 4D). Raha ampitahaina amin'ny vondrona notsaboina tamin'ny TGF-β1, nihena ny votoatin'ny mtDNA tao amin'ny vondrona notsaboina tamin'ny fitambarana (Sary 4D), izay manondro fa ny IPA dia mety hampihena ny votoatin'ny mtDNA sy mety ho ny isan'ny mitochondria ary koa ny respiration mitochondria (Sary 3C). Ankoatra izany, toa nampihena ny votoatin'ny mtDNA ny IPA tamin'ny fitsaboana mitambatra saingy tsy nisy fiantraikany tamin'ny asan'ny mitochondria vokatry ny MTR (Sary 4A–C).
Nodinihinay ny fifandraisan'ny IPA amin'ny haavon'ny mRNA amin'ny gène mifandraika amin'ny fibrosis, apoptosis, fahavelomana, ary ny dinamikan'ny mitochondria ao amin'ny sela LX-2 (Sary 5A–D). Raha ampitahaina amin'ny vondrona fanaraha-maso, ny vondrona notsaboina tamin'ny TGF-β1 dia naneho fitomboan'ny fanehoana gène toy ny rojo collagen type I α2 (COL1A2), α-smooth muscle actin (αSMA), matrix metalloproteinase 2 (MMP2), tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP1), ary dynamin 1-like gene (DRP1), izay manondro fitomboan'ny fibrosis sy ny activation. Ankoatra izany, raha ampitahaina amin'ny vondrona fanaraha-maso, ny fitsaboana TGF-β1 dia nampihena ny haavon'ny mRNA amin'ny nuclear pregnane X receptor (PXR), caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, inhibitor of B-cell α, enhancer of nuclear factor κ gene light peptide (NFκB1A), ary inhibitor of nuclear factor κB kinase subunit β (IKBKB) (Sary 5A–D). Raha ampitahaina amin'ny fitsaboana TGF-β1, ny fitsaboana mitambatra amin'ny TGF-β1 sy IPA dia nampihena ny fanehoana ny COL1A2 sy MMP2, saingy nampitombo ny haavon'ny mRNA an'ny PXR, TIMP1, B-cell lymphoma-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, ary IKBKB. Ny fitsaboana IPA dia nampihena be ny fanehoana ny MMP2, ny proteinina X mifandray amin'ny Bcl-2 (BAX), AKT1, ny proteinina atrophy optic 1 (OPA1), ary ny proteinina fusion mitochondrial 2 (MFN2), raha toa kosa ka nitombo ny fanehoana ny CASP8, NFκB1A, NFκB1B, ary IKBKB raha oharina amin'ny vondrona fanaraha-maso. Na izany aza, tsy nisy fahasamihafana hita teo amin'ny fanehoana ny caspase-3 (CASP3), ny apoptotic peptidase activating factor 1 (APAF1), ny proteinina fusion mitochondrial 1 (MFN1), ary ny proteinina fission 1 (FIS1). Raha fintinina, ireo valiny ireo dia manambara fa ny fitsaboana IPA dia manova ny fanehoana ireo fototarazo mifandraika amin'ny fibrosis, apoptosis, fahavelomana ary ny dinamikan'ny mitochondria. Ny angon-drakitray dia manambara fa ny fitsaboana IPA dia mampihena ny fibrosis ao amin'ny sela LX-2; miaraka amin'izay koa, mandrisika ny fahavelomana amin'ny alàlan'ny famindrana ny phenotype mankany amin'ny tsy fahavitrihana.
Ny IPA dia manova ny fanehoan'ny fototarazo fibroblast, apoptotic, viability, ary mitochondrial dynamics ao amin'ny sela LX-2. Ny histograms dia mampiseho ny fanehoan'ny mRNA mifandraika amin'ny fanaraha-maso endogenous (RPLP0 na PPIA) rehefa avy nampidirina tamin'ny TGF-β1 sy IPA tao anaty tontolo tsy misy serum nandritra ny 24 ora ny sela LX-2. Ny A dia manondro fibroblasts, ny B dia manondro sela apoptotic, ny C dia manondro sela velona, ​​ary ny D dia manondro ny fanehoan'ny fototarazo mitochondrial dynamics. Aseho amin'ny salan'isa ± standard deviation (SD) ny angon-drakitra, n = 3 fanandramana tsy miankina. Ny fampitahana statistika dia natao tamin'ny fampiasana ANOVA tokana sy fitsapana Bonferroni post hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Avy eo, ny fiovan'ny haben'ny sela (FSC-H) sy ny fahasarotan'ny cytoplasmika (SSC-H) dia nojerena tamin'ny alalan'ny cytometry mikoriana (Sary 6A,B), ary ny fiovan'ny morphology sela taorian'ny fitsaboana IPA dia nojerena tamin'ny alalan'ny mikroskopia elektrôna fandefasana (TEM) sy mikroskopia phase contrast (Sary Fanampiny 6A-B). Araka ny nantenaina, nitombo ny haben'ny sela ao amin'ny vondrona notsaboina tamin'ny TGF-β1 raha oharina amin'ny vondrona fanaraha-maso (Sary 6A,B), izay mampiseho ny fanitarana mahazatra ny reticulum endoplasmika (ER*) sy ny phagolysosomes (P), izay manondro ny fampahavitrihana ny sela fototra hematopoietika (HSC) (Sary Fanampiny 6A). Na izany aza, raha ampitahaina amin'ny vondrona notsaboina tamin'ny TGF-β1, ny haben'ny sela, ny fahasarotan'ny cytoplasmika (Sary 6A,B), ary ny votoatin'ny ER* dia nihena tao amin'ny vondrona fitsaboana mitambatra TGF-β1 sy IPA (Sary Fanampiny 6A). Ankoatra izany, ny fitsaboana IPA dia nampihena ny haben'ny sela, ny fahasarotan'ny cytoplasmika (Sary 6A,B), ny votoatin'ny P sy ER* (Sary Fanampiny 6A) raha oharina amin'ny vondrona fanaraha-maso. Ankoatra izany, nitombo ny isan'ny sela apoptotic taorian'ny 24 ora fitsaboana IPA raha oharina amin'ny vondrona fanaraha-maso (zana-tsipìka fotsy, Sary Fanampiny 6B). Raha fintinina, ireo valiny ireo dia manondro fa ny 1 mM IPA dia afaka mandrisika ny apoptosis HSC ary mamadika ny fiovan'ny masontsivana morphological sela vokatry ny TGF-β1, ka mandrindra ny haben'ny sela sy ny fahasarotany, izay mety mifandray amin'ny tsy fiasan'ny HSC.
Manova ny haben'ny sela sy ny fahasarotan'ny cytoplasm ao amin'ny sela LX-2 ny IPA. Sary maneho ny fanadihadiana momba ny cytometry mikoriana. Nampiasa paikady gating manokana ho an'ny sela LX-2 ny fanadihadiana: SSC-A/FSC-A mba hamaritana ny isan'ny sela, FSC-H/FSC-A mba hamantarana ny doublets, ary SSC-H/FSC-H ho an'ny fanadihadiana momba ny haben'ny sela sy ny fahasarotany. Notehirizina tamin'ny TGF-β1 (5 ng/ml) sy 1 mM IPA tao anaty medium tsy misy serum nandritra ny 24 ora ny sela. Nozaraina tao amin'ny quadrant ambany havia (SSC-H-/FSC-H-), quadrant ambony havia (SSC-H+/FSC-H-), quadrant ambany havanana (SSC-H-/FSC-H+), ary quadrant ambony havanana (SSC-H+/FSC-H+) ny sela LX-2 mba hanaovana fanadihadiana momba ny haben'ny sela sy ny fahasarotany. B. Nohadihadiana tamin'ny alalan'ny cytometry mikoriana ny morphology mampiasa FSC-H (scatter mandroso, haben'ny sela) sy SSC-H (scatter lafiny, fahasarotan'ny cytoplasm) (hetsika 30,000). Aseho amin'ny salan'isa ± SD ny angon-drakitra, n = 3 fanandramana mahaleo tena. Natao tamin'ny alalan'ny ANOVA tokana sy ny fitsapana Bonferroni post hoc ny fampitahana statistika. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 ary ****p < 0.0001
Ireo metabolita ao amin'ny tsinay toy ny IPA dia lasa lohahevitra mafana amin'ny fikarohana, izay manambara fa mety hisy lasibatra vaovao hita ao amin'ny mikrôbiota ao amin'ny tsinay. Noho izany dia mahaliana fa ny IPA, metabolita izay nampifandraisinay tamin'ny fibrosis amin'ny aty amin'ny olombelona [15], dia naseho ho singa mety ho anti-fibrotic amin'ny modely biby [13, 14]. Eto izahay dia mampiseho voalohany ny fifandraisana misy eo amin'ny IPA serum sy ny transcriptomics amin'ny aty manerantany ary ny methylation ADN amin'ny olona matavy loatra tsy misy diabeta karazany 2 (T2D), izay manasongadina ny apoptosis, mitophagy ary ny faharetan'ny androm-piainana, ary koa ny mety ho kandida gène AKT1 izay mandrindra ny homeostasis amin'ny aty. Zava-baovao iray hafa amin'ny fianarantsika ny nanehoanay ny fifandraisan'ny fitsaboana IPA amin'ny apoptosis, ny morphology sela, ny bioenergetics mitochondrial ary ny dinamika ao amin'ny sela LX-2, izay manondro ny spektrum angovo ambany kokoa izay manova ny phenotype HSC mankany amin'ny inactivation, ka mahatonga ny IPA ho kandida mety hanatsara ny fibrosis amin'ny aty.
Hitanay fa ny apoptosis, ny mitophagy ary ny faharetan'ny androm-piainana no lalan-kizorana kanonika manan-danja indrindra manankarena amin'ny fototarazon'ny aty mifandraika amin'ny IPA miparitaka ao amin'ny serum. Ny fikorontanan'ny rafitra fanaraha-maso ny kalitaon'ny mitochondrial (MQC) dia mety hiteraka tsy fahatomombanan'ny mitochondrial, mitophagy ary apoptosis, ka mampiroborobo ny fisian'ny MASLD [33, 34]. Noho izany, afaka maminavina isika fa ny IPA dia mety ho tafiditra amin'ny fitazonana ny dinamikan'ny sela sy ny fahamarinan'ny mitochondrial amin'ny alàlan'ny apoptosis, mitophagy ary faharetan'ny androm-piainana ao amin'ny aty. Ny angon-drakitray dia naneho fa ny fototarazo roa dia iraisana amin'ny fanadihadiana telo: YKT6 sy AKT1. Tsara homarihina fa ny YKT6 dia proteinina SNARE izay tafiditra amin'ny fizotran'ny fampifangaroana ny fonon'ny sela. Mitana anjara toerana amin'ny autophagy sy mitophagy izy io amin'ny alàlan'ny fananganana complexe fanombohana miaraka amin'ny STX17 sy SNAP29 amin'ny autophagosome, ka mampiroborobo ny fampifangaroana ny autophagosomes sy lysosomes [35]. Ankoatra izany, ny fahaverezan'ny asan'ny YKT6 dia miteraka fahasimban'ny mitophagy [36], raha ny fiakaran'ny YKT6 kosa dia mifandray amin'ny fivoaran'ny hepatocellular carcinoma (HCC), izay mampiseho fitomboan'ny fahaveloman'ny sela [37]. Etsy ankilany, ny AKT1 no fototarazo ifandraisana manan-danja indrindra ary mitana anjara toerana lehibe amin'ny aretin'ny aty, anisan'izany ny lalan'ny famantarana PI3K/AKT, ny tsingerin'ny sela, ny fifindra-monin'ny sela, ny fihanaky ny sela, ny fifamatorana focal, ny fiasan'ny mitochondria, ary ny famoahana collagen [38–40]. Ny lalan'ny famantarana PI3K/AKT miasa dia afaka mampihetsika ny sela fototra hematopoietic (HSCs), izay sela tompon'andraikitra amin'ny famokarana matrix extracellular (ECM), ary ny tsy fahatomombanan'ny fandrindrana azy dia mety handray anjara amin'ny fisian'ny sy ny fivoaran'ny fibrosis aty [40]. Ankoatra izany, ny AKT dia iray amin'ireo anton-javatra fototra amin'ny fahaveloman'ny sela izay manakana ny apoptosis sela miankina amin'ny p53, ary ny fampahavitrihana AKT dia mety mifandray amin'ny fanakanana ny apoptosis sela aty [41, 42]. Ny valiny azo dia manondro fa ny IPA dia mety ho tafiditra amin'ny apoptosis mifandraika amin'ny mitochondria aty amin'ny alàlan'ny fiantraikany amin'ny fanapahan-kevitry ny hepatocytes eo amin'ny fidirana amin'ny apoptosis na ny fahavelomana. Ireo fiantraikany ireo dia mety fehezin'ny fototarazo kandidà AKT sy/na YKT6, izay tena ilaina amin'ny homeostasis aty.
Nasehon'ny valin'ny fikarohanay fa ny 1 mM IPA dia nahatonga apoptosis ary nihena ny respiration mitochondrial tao amin'ny sela LX-2 tsy miankina amin'ny fitsaboana TGF-β1. Tsara homarihina fa ny apoptosis dia lalana lehibe ho an'ny famahana ny fibrosis sy ny fampahavitrihana ny sela fototra hematopoietic (HSC), ary zava-dehibe ihany koa amin'ny valinteny ara-batana azo averina amin'ny laoniny amin'ny fibrosis aty [4, 43]. Ankoatra izany, ny famerenana amin'ny laoniny ny BHI ao amin'ny sela LX-2 taorian'ny fitsaboana mitambatra dia nanome fahatakarana vaovao momba ny mety ho anjara asan'ny IPA amin'ny fandrindrana ny bioenergetics mitochondrial. Amin'ny toe-javatra fitsaharana sy tsy mavitrika, ny sela hematopoietic dia mazàna mampiasa ny phosphorylation oxidative mitochondrial mba hamokarana ATP ary manana hetsika metabolika ambany. Etsy ankilany, ny fampahavitrihana HSC dia manatsara ny respiration sy ny biosynthesis mitochondrial mba hanonerana ny filàna angovo amin'ny fidirana amin'ny toetry ny glycolytic [44]. Ny zava-misy fa ny IPA dia tsy nisy fiantraikany tamin'ny mety ho metabolisma sy ny ECAR dia manondro fa ny lalan'ny glycolytic dia tsy dia laharam-pahamehana loatra. Toy izany koa, ny fanadihadiana iray hafa dia naneho fa ny 1 mM IPA dia afaka manova ny asan'ny rojo taovam-pisefoana mitochondrial ao amin'ny cardiomyocytes, ny tsipika sela hepatocyte olombelona (Huh7) ary ny sela endothelial vein umbilical olombelona (HUVEC); Na izany aza, tsy nisy fiantraikan'ny IPA hita teo amin'ny glycolysis tao amin'ny cardiomyocytes, izay manambara fa mety hisy fiantraikany amin'ny bioenergetics amin'ny karazana sela hafa ny IPA [45]. Noho izany, dia heverinay fa ny 1 mM IPA dia mety hiasa ho toy ny mpanasaraka simika malefaka, satria afaka mampihena be ny fanehoana ny fototarazo fibrogenic, ny morphology sela ary ny bioenergetics mitochondrial tsy manova ny habetsaky ny mtDNA [46]. Ny mpanasaraka mitochondrial dia afaka manakana ny fibrosis vokatry ny kolontsaina sy ny fampahavitrihana HSC [47] ary mampihena ny famokarana ATP mitochondrial izay fehezin'ny na vokatry ny proteinina sasany toy ny proteinina mpanasaraka (UCP) na adenine nucleotide translocase (ANT). Miankina amin'ny karazana sela, ity trangan-javatra ity dia afaka miaro ny sela amin'ny apoptosis sy/na mampiroborobo ny apoptosis [46]. Na izany aza, ilaina ny fanadihadiana fanampiny mba hanazavana ny anjara asan'ny IPA amin'ny maha-manasaraka mitochondrial azy amin'ny tsy fampahavitrihana ny sela fototra hematopoietic.
Avy eo dia nodinihinay raha toa ka hita taratra amin'ny endriky ny mitochondria ao amin'ny sela LX-2 velona ny fiovan'ny respiration mitochondria. Mahaliana fa ny fitsaboana TGF-β1 dia manova ny ampahany mitochondria avy amin'ny boribory mankany amin'ny antonony, miaraka amin'ny fihenan'ny sampana mitochondria sy ny fitomboan'ny fanehoana ny DRP1, izay anton-javatra fototra amin'ny fission mitochondria [48]. Ankoatra izany, ny fizarazarana mitochondria dia mifandray amin'ny fahasarotan'ny tambajotra amin'ny ankapobeny, ary ny fifindrana avy amin'ny fusion mankany amin'ny fission dia tena ilaina amin'ny fampandehanana ny sela fototra hematopoietika (HSC), raha toa kosa ny fanakanana ny fission mitochondria dia mitarika amin'ny apoptosis HSC [49]. Noho izany, ny valin'ny fikarohanay dia manondro fa ny fitsaboana TGF-β1 dia mety hiteraka fihenan'ny fahasarotan'ny tambajotra mitochondria miaraka amin'ny fihenan'ny sampana, izay mahazatra kokoa amin'ny fission mitochondria mifandraika amin'ny sela fototra hematopoietika (HSC) mavitrika. Ankoatra izany, ny angon-drakitray dia naneho fa ny IPA dia afaka manova ny ampahany amin'ny mitochondria avy amin'ny boribory mankany amin'ny endrika antonony, ka mampihena ny fanehoana ny OPA1 sy MFN2. Ny fanadihadiana dia naneho fa ny fihenan'ny OPA1 dia mety hiteraka fihenan'ny mety ho an'ny membrane mitochondria ary miteraka apoptosis sela [50]. Ny MFN2 dia fantatra fa mpanelanelana ny fusion mitochondria sy ny apoptosis [51]. Ny valiny azo dia manondro fa ny fampahavitrihana ny sela LX-2 ataon'ny TGF-β1 sy/na IPA dia toa manova ny endrika sy ny haben'ny mitochondria, ary koa ny toetry ny fampahavitrihana sy ny fahasarotan'ny tambajotra.
Ny valin'ny fikarohanay dia mampiseho fa ny fitsaboana miaraka amin'ny TGFβ-1 sy IPA dia afaka mampihena ny mtDNA sy ny masontsivana morfolojikan'ny sela amin'ny alàlan'ny fanaraha-maso ny fanehoana mRNA ny fibrosis, apoptosis ary ireo fototarazo mifandraika amin'ny fahavelomana ao amin'ny sela misoroka ny apoptosis. Eny tokoa, ny IPA dia nampihena ny haavon'ny fanehoana mRNA an'ny AKT1 sy ireo fototarazo fibrosis manan-danja toy ny COL1A2 sy MMP2, saingy nampitombo ny haavon'ny fanehoana CASP8, izay mifandray amin'ny apoptosis. Ny valin'ny fikarohanay dia naneho fa taorian'ny fitsaboana IPA, dia nihena ny fanehoana BAX ary nitombo ny fanehoana mRNA an'ny vondrona fianakaviana TIMP1, BCL-2 ary NF-κB, izay manondro fa ny IPA dia afaka mandrisika ny famantarana fahavelomana ao amin'ny sela fototra hematopoietika (HSCs) izay misoroka ny apoptosis. Ireo molekiola ireo dia mety hiasa ho famantarana pro-survival ao amin'ny sela fototra hematopoietika miasa, izay mety mifandray amin'ny fitomboan'ny fanehoana proteinina anti-apoptotic (toy ny Bcl-2), fihenan'ny fanehoana pro-apoptotic BAX, ary fifandraisana sarotra eo amin'ny TIMP sy NF-κB [5, 7]. Mampihatra ny vokany amin'ny alàlan'ny PXR ny IPA, ary hitanay fa ny fitsaboana miaraka amin'ny TGF-β1 sy IPA dia nampitombo ny haavon'ny fanehoana ny mRNA PXR, izay manondro ny fampihenana ny fampahavitrihana ny HSC. Ny famantarana PXR mavitrika dia fantatra fa manakana ny fampahavitrihana ny HSC na in vivo na in vitro [52, 53]. Ny valin'ny fikarohanay dia manondro fa ny IPA dia mety handray anjara amin'ny fanadiovana ny HSC mavitrika amin'ny alàlan'ny fampiroboroboana ny apoptosis, ny fampihenana ny metabolisman'ny fibrosis sy mitochondrial, ary ny fanamafisana ny famantarana ny fahavelomana, izay dingana mahazatra izay manova ny phenotype HSC mavitrika ho tsy mavitrika. Ny fanazavana iray hafa mety ho an'ny mekanisma sy ny anjara asan'ny IPA amin'ny apoptosis dia ny fanesorana ny mitochondria tsy miasa amin'ny alàlan'ny mitophagy (lalan'ny anatiny) sy ny lalan'ny famantarana TNF ivelany (Tabilao 1), izay mifandray mivantana amin'ny lalan'ny famantarana ny fahavelomana NF-κB (Sary Fanampiny 7). Mahaliana fa ny fototarazo manankarena mifandraika amin'ny IPA dia afaka miteraka famantarana pro-apoptotic sy pro-survival amin'ny lalan'ny apoptotic [54], izay manondro fa ny IPA dia mety hiteraka ny lalan'ny apoptotic na ny fahavelomana amin'ny alàlan'ny fifandraisana amin'ireo fototarazo ireo. Na izany aza, mbola tsy mazava ny fomba itarihan'ny IPA ny apoptosis na ny fahavelomana mandritra ny fampahavitrihana ny HSC sy ny lalan'ny mekanismany.
Ny IPA dia metabolite mikraoba niforona avy amin'ny tryptophan avy amin'ny sakafo amin'ny alàlan'ny microbiota ao amin'ny tsinay. Ny fanadihadiana dia naneho fa manana toetra manohitra ny fivontosana, antioxidant ary epigenetic ao amin'ny tontolo tsinay izy io.[55] Ny fanadihadiana dia naneho fa ny IPA dia afaka manova ny fiasan'ny sakana amin'ny tsinay ary mampihena ny adin-tsaina oxidative, izay mety handray anjara amin'ny fiantraikany ara-batana eo an-toerana.[56] Raha ny marina, ny IPA dia entina mankany amin'ny taova kendrena amin'ny alàlan'ny fivezivezena, ary satria ny IPA dia mizara rafitra metabolite lehibe mitovy amin'ny tryptophan, serotonin, ary indole derivatives, ny IPA dia mampihatra hetsika metabolika ka miteraka fifaninanana metabolika.[52] Ny IPA dia mety hifaninana amin'ny metabolites avy amin'ny tryptophan amin'ny toerana mifamatotra amin'ny anzima na receptors, izay mety hanelingelina ny lalan'ny metabolika ara-dalàna. Izany dia manasongadina ny filàna fanadihadiana bebe kokoa momba ny pharmacokinetics sy ny pharmacodynamics mba hahatakarana bebe kokoa ny varavarankelin'ny fitsaboana azy.[57] Mbola ho hita eo raha mety hitranga amin'ny sela fototra hematopoietic (HSCs) koa izany.
Miaiky izahay fa misy fetrany ny fanadihadianay. Mba handinihana manokana ny fifandraisana mifandraika amin'ny IPA, dia nesorinay ireo marary voan'ny diabeta karazany 2 (T2DM). Miaiky izahay fa mametra ny fampiharana mivelatra ny zavatra hitanay amin'ny marary voan'ny diabeta karazany 2 sy ny aretin'aty mandroso izany. Na dia 1–10 μM aza ny fifantohana ara-batana amin'ny IPA ao amin'ny serum olombelona [11, 20], dia nofidiana ny fifantohana 1 mM IPA mifototra amin'ny fifantohana tsy misy poizina avo indrindra [15] sy ny tahan'ny apoptosis avo indrindra, tsy misy fahasamihafana amin'ny isan-jaton'ny mponina sela necrotic. Na dia nampiasaina tamin'ity fanadihadiana ity aza ny haavon'ny IPA supraphysiological, dia tsy misy marimaritra iraisana amin'izao fotoana izao momba ny fatra mahomby amin'ny IPA [52]. Na dia manan-danja aza ny valin'ny fanadihadianay, dia mbola sehatra fikarohana mavitrika ny fiantraikan'ny metabolisman'ny IPA amin'ny ankapobeny. Ankoatra izany, ny zavatra hitanay momba ny fifandraisana misy eo amin'ny haavon'ny IPA serum sy ny methylation ADN amin'ny transcripts amin'ny aty dia tsy avy amin'ny sela fototra hematopoietic (HSCs) ihany fa avy amin'ny sela aty koa. Nisafidy ny hampiasa sela LX-2 olombelona izahay mifototra amin'ny zavatra hitanay teo aloha avy amin'ny fanadihadiana transcriptome fa ny IPA dia mifandray amin'ny fampahavitrihana ny sela fototra hematopoietic (HSC) [15], ary ny HSCs no sela lehibe tafiditra amin'ny fivoaran'ny fibrosis aty. Ny aty dia ahitana karazana sela maro, noho izany dia tokony hodinihina ireo modely sela hafa toy ny rafitra fiaraha-miompy sela hepatocyte-HSC-immune miaraka amin'ny fampahavitrihana caspase sy ny fizarazarana ADN ary koa ny mekanisma fiasan'ny proteinina mba handinihana ny anjara asan'ny IPA sy ny fifandraisany amin'ny karazana sela aty hafa.