Misaotra anao nitsidika ny Nature.com. Voafetra ny fanohanana CSS amin'ny dikan-tranonkala ampiasainao. Ho an'ny vokatra tsara indrindra, manoro hevitra anao izahay hampiasa dikan-tranonkala vaovao kokoa (na hanafoana ny Compatibility Mode ao amin'ny Internet Explorer). Mandritra izany fotoana izany, mba hahazoana antoka fa mitohy ny fanohanana, dia asehoy ny tranonkala tsy misy endrika na JavaScript.
Ampiasaina handinihana ny anjara asan'ny tsy fahatomombanan'ny mitochondria amin'ny aretina ara-pandrefesana toy ny fikorontanan'ny autisme spectrum ny asidra propionika (PPA). Fantatra fa manakorontana ny biogenesis, ny metabolisma ary ny fiovan'ny mitochondria ny PPA. Na izany aza, mbola olana ny fiantraikan'ny PPA amin'ny dinamika mitochondria, ny fission ary ny fusion noho ny toetra ara-potoana sarotra an'ireo mekanisma ireo. Eto izahay dia mampiasa teknika sary quantitative mifameno mba handinihana ny fiantraikan'ny PPA amin'ny ultrastructure, morphology ary dinamika mitochondria ao amin'ny sela SH-SY5Y mitovy amin'ny neuron. Ny PPA (5 mM) dia nahatonga fihenana be teo amin'ny velaran'ny mitochondria (p < 0.01), ny savaivony sy ny manodidina ny feret (p < 0.05), ary ny velaran'ny 2 (p < 0.01). Ny fanadihadiana ny toerana misy ny hetsika mitochondria dia naneho fitomboana be (p < 0.05) amin'ny hetsika fission sy fusion, ka mitazona ny fahamarinan'ny tambajotra mitochondria amin'ny toe-javatra misy tsindry. Ankoatra izany, nihena be ny fanehoana mRNA an'ny cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) ary OPA1 (p < 0.05). Izany dia mampiseho ny fanavaozana ny morphology, biogenesis ary dinamika mitochondrial mba hitazonana ny fiasa ao anatin'ny toe-javatra misy fihenjanana. Ny angon-drakitray dia manome fahatakarana vaovao momba ny fiantraikan'ny PPA amin'ny dinamika mitochondrial ary manasongadina ny fampiasana teknika fakana sary ho an'ny fandalinana ireo mekanisma mifehy sarotra tafiditra amin'ny valin'ny fihenjanana mitochondrial.
Mandray anjara mavitrika amin'ny asa sela isan-karazany ny Mitokondria ankoatra ny anjara asany mahazatra amin'ny famokarana angovo sy ny biosynthesis. Ny metabolisman'ny Mitokondria dia mpandrindra fototra ny famantarana kalsioma, ny homeostasis metabolika sy redox, ny famantarana mamaivay, ny fanovana epigenetika, ny fihanaky ny sela, ny fiforonan'ny sela ary ny fahafatesan'ny sela voarindra1. Indrindra indrindra, ny metabolisman'ny mitokondria dia tena ilaina amin'ny fivoaran'ny neurona, ny fahavelomana ary ny fiasan'ny sela ary tafiditra betsaka amin'ny fisehoan'ny neuropathologie isan-karazany2,3,4.
Nandritra ny folo taona lasa, ny toetry ny metabolisma dia nipoitra ho toy ny mpandrindra foibe ny neurogenesis, ny differentiation, ny maturation ary ny plasticity5,6. Vao haingana, ny morphology sy ny dinamikan'ny mitochondria dia lasa singa manan-danja indrindra amin'ny mitosis, dingana dinamika izay mitazona vondron'ny mitochondria salama ao anatin'ny sela. Ny dinamikan'ny mitochondria dia fehezin'ny lalana mifampiankina sarotra manomboka amin'ny biogenesis mitochondrial sy bioenergetics ka hatramin'ny fission, fusion, transport ary clearance mitochondrial7,8. Ny fikorontanan'ny iray amin'ireo mekanisma fampidirana ireo dia manimba ny fitazonana ny tambajotra mitochondrial salama ary misy fiantraikany lalina amin'ny fivoaran'ny neuro9,10. Eny tokoa, ny tsy fanarahan-dalàna ny dinamikan'ny mitochondrial dia hita amin'ny aretina ara-tsaina, neurodegenerative ary neurodevelopmental maro, anisan'izany ny autism spectrum disorders (ASD)11,12.
Ny ASD dia aretina tsy mitovy amin'ny fivoaran'ny atidoha miaraka amin'ny maritrano fototarazo sy epigenetika sarotra. Tsy iadian-kevitra ny maha-lova ny ASD, saingy mbola tsy mazava tsara ny antony molekiola fototra. Ny angon-drakitra nangonina avy amin'ny modely preclinical, fanadihadiana klinika, ary angon-drakitra molekiola multi-omics dia manome porofo mitombo momba ny tsy fahombiazan'ny mitochondria amin'ny ASD13,14. Nanao fitiliana methylation ADN manerana ny genome izahay teo aloha tamin'ny andiana marary voan'ny ASD ary namantatra ireo fototarazo methylated samihafa miangona manaraka ny lalan'ny metabolika mitochondria15. Taorian'izay dia nitatitra ny methylation samihafa amin'ny mpandrindra foibe amin'ny biogenesis sy dinamika mitochondria izahay, izay mifandray amin'ny fitomboan'ny isan'ny kopian'ny mtDNA sy ny fiovan'ny mombamomba ny metabolika urinary amin'ny ASD16. Ny angon-drakitray dia manome porofo mitombo fa ny dinamika mitochondria sy ny homeostasis dia mitana anjara toerana lehibe amin'ny pathophysiology amin'ny ASD. Noho izany, ny fanatsarana ny fahatakarana mekanisma momba ny fifandraisana misy eo amin'ny dinamika mitochondria, ny morphology, ary ny fiasan'ny dia tanjona fototra amin'ny fikarohana mitohy momba ny aretina neurolojika miavaka amin'ny tsy fahombiazan'ny mitochondria faharoa.
Matetika ampiasaina handinihana ny anjara asan'ny fototarazo manokana amin'ny valin'ny adin-tsaina mitochondrial ny teknika molekiola. Na izany aza, mety ho voafetra io fomba fiasa io noho ny toetra marolafy sy ara-potoanan'ny mekanisma fanaraha-maso ny mitotika. Ankoatra izany, ny fanehoana samihafa ny fototarazo mitochondrial dia famantarana ankolaka ny fiovana ara-asa, indrindra satria voafetra ihany ny isan'ny fototarazo dinihina matetika. Noho izany, dia nisy fomba mivantana kokoa naroso handinihana ny fiasan'ny mitochondrial sy ny bioenergetics17. Mifandray akaiky amin'ny dinamikan'ny mitochondrial ny morphology mitochondrial. Ny endrika, ny fifandraisana ary ny rafitra mitochondrial dia tena ilaina amin'ny famokarana angovo sy ny fahaveloman'ny mitochondrial sy ny sela5,18. Ankoatra izany, ireo singa isan-karazany amin'ny mitosis dia mifantoka amin'ny fiovan'ny morphology mitochondrial, izay mety ho teboka farany mahasoa amin'ny tsy fahatomombanan'ny mitochondrial ary manome fototra ho an'ny fanadihadiana mekanisma manaraka.
Azo jerena mivantana amin'ny alalan'ny mikroskopia elektrôna fandefasana (TEM) ny endriky ny mitochondria, izay ahafahana mandalina amin'ny antsipiriany ny firafitry ny sela. Ny TEM dia mampiseho mivantana ny endriky ny cristae mitochondria amin'ny famaha ny mitochondria tsirairay, fa tsy miankina fotsiny amin'ny fandikana ny fototarazo, ny fanehoana proteinina na ny masontsivana fiasan'ny mitochondria ao amin'ny sela17,19,20. Ankoatra izany, ny TEM dia manamora ny fandalinana ny fifandraisana misy eo amin'ny mitochondria sy ny organelles hafa, toy ny reticulum endoplasmic sy autophagosomes, izay mitana anjara toerana lehibe amin'ny fiasan'ny mitochondria sy ny homeostasis21,22. Noho izany, izany dia mahatonga ny TEM ho toerana tsara hanombohana ny fandalinana ny tsy fahatomombanan'ny mitochondria alohan'ny hifantohana amin'ny lalan-kely na fototarazo manokana. Rehefa miha-zava-dehibe amin'ny neuropathologie ny fiasan'ny mitochondria, dia misy filàna mazava ny fahafahana mandalina mivantana sy amin'ny habetsahana ny endriky ny mitochondria sy ny dinamika ao amin'ny modely neuronal in vitro.
Ato amin'ity lahatsoratra ity, dia handinika ny dinamikan'ny mitochondria ao amin'ny modely neuronal momba ny tsy fahatomombanan'ny mitochondria amin'ny fikorontanan'ny autism spectrum isika. Efa nitatitra momba ny methylation samihafa amin'ny propionyl-CoA carboxylase beta (PCCB) ao amin'ny ASD15 izahay, izay singa iray ao amin'ny anzima propionyl-CoA carboxylase PCC. Ny tsy fahatomombanan'ny PCC dia fantatra fa miteraka fanangonan-karena misy poizina amin'ny propionyl derivatives, anisan'izany ny asidra propionic (PPA)23,24,25. Ny PPA dia naseho fa manakorontana ny metabolisman'ny neuronal sy manova ny fitondran-tena in vivo ary modely biby efa voaporofo ho an'ny fandalinana ny mekanisma neurodevelopmental tafiditra amin'ny ASD26,27,28. Fanampin'izany, ny PPA dia voalaza fa manakorontana ny mety ho vitan'ny membrane mitochondrial, ny biogenesis ary ny respiration in vitro ary efa nampiasaina betsaka mba hamolavolana ny tsy fahatomombanan'ny mitochondrial ao amin'ny neurons29,30. Na izany aza, ny fiantraikan'ny tsy fahatomombanan'ny mitochondrial vokatry ny PPA amin'ny morphology sy ny dinamikan'ny mitochondrial dia mbola tsy mazava tsara.
Ity fandalinana ity dia mampiasa teknika sary mifameno mba handrefesana ny fiantraikan'ny PPA amin'ny morphology, dinamika ary ny fiasan'ny mitochondria ao amin'ny sela SH-SY5Y. Voalohany, namorona fomba TEM izahay mba hijerena ny fiovan'ny morphology sy ny ultrastructure mitochondria17,31,32. Noho ny toetra dinamikan'ny mitochondria33, dia nampiasa fanadihadiana mitochondrial event localizer (MEL) ihany koa izahay mba handrefesana ny fiovan'ny fifandanjana eo amin'ny fission sy fusion, ny isa ary ny volume mitochondrial eo ambany fihenjanana PPA. Farany, nodinihinay raha mifandray amin'ny fiovan'ny fanehoana ny fototarazo tafiditra amin'ny biogenesis, fission ary fusion ny morphology sy ny dinamikan'ny mitochondrial. Raha fintinina, ny angon-drakitray dia mampiseho ny fanamby amin'ny fanazavana ny fahasarotan'ny mekanisma mifehy ny dinamikan'ny mitochondrial. Asongadinonay ny maha-ilaina ny TEM amin'ny fandalinana ny morphology mitochondrial ho toy ny teboka farany azo refesina amin'ny mitosis ao amin'ny sela SH-SY5Y. Fanampin'izany, asongadinonay fa ny angon-drakitra TEM dia manome fampahalalana manankarena indrindra rehefa ampiarahina amin'ny teknika sary izay maka ihany koa ny hetsika dinamika ho setrin'ny fihenjanana metabolika. Ny famaritana bebe kokoa ny mekanisma mifehy molekiola izay manohana ny mitosis sela neuronal dia mety hanome fahatakarana manan-danja momba ny singa mitochondrial amin'ny rafi-pitatitra sy ny aretina neurodegenerative.
Mba hampisy ny adin-tsaina mitochondrial, ny sela SH-SY5Y dia notsaboina tamin'ny PPA tamin'ny fampiasana sodium propionate (NaP) 3 mM sy 5 mM. Talohan'ny TEM, ny santionany dia nomanina tamin'ny alalan'ny cryogenic tamin'ny fampiasana ny fampangatsiahana sy ny fampangatsiahana amin'ny tsindry avo lenta (Sary 1a). Namolavola fantsona famakafakana sary mitochondrial mandeha ho azy izahay mba handrefesana ny masontsivana morphological valo amin'ny mponina mitochondrial amin'ny replica biolojika telo. Hitanay fa ny fitsaboana PPA dia nanova be ny masontsivana efatra: ny faritra 2, ny faritra, ny perimeter, ary ny savaivony Feret (Sary 1b–e). Nihena be ny faritra 2 tamin'ny fitsaboana PPA 3 mM sy 5 mM (p = 0.0183 sy p = 0.002, tsirairay avy) (Sary 1b), raha toa ka nihena be ny faritra (p = 0.003), ny perimeter (p = 0.0106) ary ny savaivony Feret. Nisy fihenana be (p = 0.0172) tao amin'ny vondrona fitsaboana 5 mM raha oharina amin'ny vondrona fanaraha-maso (Sary 1c–e). Ny fihenan'ny velarany sy ny manodidina dia naneho fa ny sela notsaboina tamin'ny PPA 5 mM dia nanana mitochondria kely kokoa sy boribory kokoa, ary ireo mitochondria ireo dia tsy dia lava kokoa noho ireo ao amin'ny sela fanaraha-maso. Mifanaraka amin'ny fihenan'ny savaivony Feret ihany koa izany, izay masontsivana mahaleo tena izay manondro ny fihenan'ny elanelana lehibe indrindra eo amin'ny sisin'ny poti-javatra. Hita ny fiovana eo amin'ny ultrastructure an'ny cristae: nanjary tsy dia niharihary loatra ny cristae teo ambany fiantraikan'ny stress PPA (Sary 1a, tontonana B). Na izany aza, tsy ny sary rehetra no naneho mazava tsara ny ultrastructure an'ny cristae, ka tsy nisy fanadihadiana momba ireo fiovana ireo natao. Ireo angon-drakitra TEM ireo dia mety maneho toe-javatra telo mety hitranga: (1) ny PPA dia mampitombo ny fission na manakana ny fusion, ka mahatonga ny mitochondria efa misy hihena ny habeny; (2) ny biogenesis nohatsaraina dia mamorona mitochondria vaovao sy kely kokoa na (3) miteraka ireo mekanisma roa miaraka. Na dia tsy azo avahana amin'ny TEM aza ireo toe-javatra ireo, ny fiovana morphological manan-danja dia manondro ny fiovana eo amin'ny homeostasis sy ny dinamika mitochondrial eo ambany stress PPA. Taorian'izay dia nojerenay ireo masontsivana fanampiny mba hamaritana bebe kokoa ireo dinamika ireo sy ireo mekanisma mety ho fototry azy ireo.
Manova ny endriky ny mitochondria ny asidra propionika (PPA). (a) Sary mikroskopia elektrônika fandefasana solontena (TEM) mampiseho fa mihena ny haben'ny mitochondria ary mihakely sy boribory kokoa ny mitochondria miaraka amin'ny fitomboan'ny fitsaboana PPA; 0 mM (tsy voatsabo), 3 mM ary 5 mM, tsirairay avy. Ny zana-tsipìka mena dia manondro mitochondria. (b–e) Ny sela SH-SY5Y notsaboina tamin'ny PPA nandritra ny 24 ora dia nomanina ho an'ny TEM ary nohadihadiana tamin'ny fampiasana Fiji/ImageJ ny valiny. Efatra amin'ireo masontsivana valo no naneho fahasamihafana manan-danja teo amin'ny sela fanaraha-maso (tsy voatsabo, 0 mM PPA) sy ny sela notsaboina (3 mM sy 5 mM PPA). (b) Faritra 2, (c) Faritra, (d) Vanim-potoana, (e) Savaivony Feret. Ny fanadihadiana tokana momba ny fiovaovana (fanaraha-maso vs. fitsaboana) sy ny fitsapana fampitahana marobe an'i Dunnett dia nampiasaina mba hamaritana ny fahasamihafana manan-danja (p < 0.05). Ny teboka angona dia maneho ny salan'isa mitochondria ho an'ny sela tsirairay, ary ny bara diso dia maneho ny salan'isa ± SEM. Ny angona aseho dia maneho ny n = 3, farafahakeliny sela 24 isaky ny famerenana; sary miisa 266 no nohadihadiana; * midika hoe p < 0.05, ** midika hoe p < 0.01.
Mba hanazavana bebe kokoa ny fomba fiatrehan'ny dinamikan'ny mitochondria ny PPA, dia nolokoinay tamin'ny tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) ny mitochondria ary nampiasa mikroskopia time-lapse sy fanadihadiana MEL izahay mba hamaritana sy handrefesana ny mitochondria aorian'ny 24 ora amin'ny 3 sy 5 mM PPA. Fitsaboana ny fission sy fusion. (Sary 2a). Taorian'ny fanadihadiana MEL, dia nohadihadiana bebe kokoa ny mitochondria mba handrefesana ny isan'ny rafitra mitochondria sy ny salan'isa. Nahita fitomboana kely nefa manan-danja teo amin'ny isan'ny fission nitranga tamin'ny 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] raha oharina amin'ny fission [5.6 ± 0.3 (p < 0.05) )] ary ny fusion [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] sy ny fusion [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] <0.05)] dia nitombo be tamin'ny 5 mM raha oharina amin'ny fanaraha-maso (Sary 3b). Nitombo be ny isan'ny mitochondria tamin'ny 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] sy 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (Sary 3c), raha toa kosa ka tsy niova ny salan'isan'ny haben'ny rafitra mitochondria tsirairay (Sary 3c). 3d). Raha fintinina, dia midika izany fa ny fanavaozana ny dinamikan'ny mitochondria dia toy ny valinteny fanonerana izay mitazona am-pahombiazana ny fahamarinan'ny tambajotra mitochondria. Ny fitomboan'ny isan'ny tranganà fission amin'ny 3 mM PPA dia manondro fa ny fitomboan'ny isan'ny mitochondria dia vokatry ny fission mitochondria, saingy satria tsy miova ny salan'isan'ny haben'ny mitochondria, dia tsy azo lavina fa valinteny fanonerana fanampiny ny biogenesis. Na izany aza, ireo angon-drakitra ireo dia mifanaraka amin'ireo rafitra mitochondria boribory kely kokoa hita tamin'ny TEM ary mampiseho fiovana lehibe eo amin'ny dinamikan'ny mitochondria vokatry ny PPA.
Ny asidra propionika (PPA) dia miteraka fanavaozana mitochondrial mavitrika mba hihazonana ny fahamarinan'ny tambajotra. Nokolokoloina ny sela SH-SY5Y, notsaboina tamin'ny PPA 3 sy 5 mM nandritra ny 24 ora ary nolokoina tamin'ny TMRE sy Hoechst 33342 arahin'ny fanadihadiana MEL. (a) Sary mikroskopia maneho ny loko sy ny vinavina amin'ny hamafin'ny binarised amin'ny fotoana 2 (t2) ho an'ny toe-javatra tsirairay. Ireo faritra voafantina aseho amin'ny sary binary tsirairay dia nohatsaraina ary aseho amin'ny 3D amin'ny fe-potoana telo samihafa (t1-t3) mba hanehoana ny dinamika rehefa mandeha ny fotoana; ny hetsika fusion dia asongadina amin'ny maitso; ny hetsika fission dia asongadina amin'ny maitso. Aseho amin'ny mena. (b) Isan'ny hetsika dinamika isaky ny toe-javatra. (c) Isan'ny rafitra mitochondrial isaky ny sela. (d) Salan'isa volume (µm3) amin'ny rafitra mitochondrial tsirairay isaky ny sela. Ny angon-drakitra aseho dia maneho ny n = 15 sela isaky ny vondrona fitsaboana. Ny bara fahadisoana aseho dia maneho ny salan'isa ± SEM, bara mizana = 10 μm, * p < 0.05.
Ny asidra propionika (PPA) dia miteraka fanakanana ny fandikana ny fototarazo mifandraika amin'ny dinamikan'ny mitochondria. Ny sela SH-SY5Y dia notsaboina tamin'ny PPA 3 sy 5 mM nandritra ny 24 ora. Ny fandrefesana ny fototarazo mifandraika dia natao tamin'ny fampiasana RT-qPCR ary naverina tamin'ny laoniny ho B2M. Ny fototarazo biogenesis mitochondria (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 ary (d) NFE2L2. Ny fototarazo fusion sy fission mitochondria (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 ary (i) DRP1. Ny fahasamihafana manan-danja (p < 0.05) dia notsapaina tamin'ny fampiasana ANOVA tokana (fanaraha-maso vs. fitsaboana) sy ny fitsapana fampitahana marobe an'i Dunnett: * dia manondro p < 0.05, ** dia manondro p < 0.01, ary **** dia manondro p < 0.0001. Ny bara dia maneho ny fanehoana antonony ± SEM. Ny angon-drakitra aseho dia maneho ny n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), ary n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) dika mitovy biolojika.
Ny angon-drakitra avy amin'ny fanadihadiana TEM sy MEL miaraka dia manondro fa ny PPA dia manova ny endrika sy ny dinamikan'ny mitochondria. Na izany aza, ireo teknika fakana sary ireo dia tsy manome fahatakarana ny mekanisma fototra mitarika ireo dingana ireo. Noho izany dia nodinihinay ny fanehoana mRNA an'ireo mpandrindra sivy lehibe amin'ny dinamikan'ny mitochondria, ny biogenesis, ary ny mitosis ho setrin'ny fitsaboana PPA. Nojerenay ny oncogene myeloma cell (cMYC), ny nuclear respiratory factor (NRF1), ny mitochondrial transcription factor 1 (TFAM), ny NFE2-like transcription factor BZIP (NFE2L2), ny gastrin-like protein 2 (STOML2), ny optic nerve atrophy 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) ary ny dynamin-related protein 1 (DRP1) taorian'ny 24 ora fitsaboana tamin'ny 3 mM sy 5 mM PPA. Nahita fitsaboana PPA 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 ary p < 0.0001) sy 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) izahay. (Sary 3a–c). Miankina amin'ny fatra ny fihenan'ny fanehoana mRNA: nihena in-5.7, in-2.6 ary in-1.9 ny fanehoana cMYC, NRF1 ary TFAM tamin'ny 3 mM, ary in-11.2, in-3 ary in-2.2 tamin'ny 5 mM. Mifanohitra amin'izany kosa, ny fototarazo biogenesis redox afovoany NFE2L2 dia tsy niova tamin'ny fifantohana PPA rehetra, na dia hita aza ny fironana mitovy amin'izany amin'ny fihenan'ny fanehoana miankina amin'ny fatra (Sary 3d).
Nodinihinay ihany koa ny fanehoana ireo fototarazo klasika tafiditra amin'ny fandrindrana ny fission sy fusion. Heverina fa tafiditra amin'ny fusion, mitophagy ary biogenesis ny STOML2, ary nihena be ny fanehoana azy (p < 0.0001) tamin'ny 3 mM (fiovana 2.4 heny) sy 5 mM (fiovana 2.8 heny) PPA (Sary 1). 3d). Toy izany koa, nihena ny fanehoana ny fototarazo OPA1 fusion tamin'ny 3 mM (fiovana 1.6 heny) sy 5 mM (fiovana 1.9 heny) PPA (p = 0.006 sy p = 0.0024, tsirairay avy) (Sary 3f). Na izany aza, tsy nahita fahasamihafana lehibe teo amin'ny fanehoana ny fototarazo fusion MFN1, MFN2 na ny fototarazo fission DRP1 teo ambanin'ny fihenjanana PPA 24 ora izahay (Sary 3g–i). Ankoatra izany, hitanay fa tsy niova ny haavon'ny proteinina fusion sy fission efatra (OPA1, MFN1, MFN2 ary DRP1) tao anatin'ny toe-javatra mitovy (Sary 4a–d). Zava-dehibe ny manamarika fa ireo angon-drakitra ireo dia maneho teboka tokana amin'ny fotoana iray ary mety tsy maneho ny fiovan'ny fanehoana proteinina na ny haavon'ny asa mandritra ny dingana voalohany amin'ny adin-tsaina PPA. Na izany aza, ny fihenan'ny fanehoana cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, ary OPA1 dia manondro ny tsy fahatomombanan'ny fandikana ny metabolisma, ny biogenesis ary ny dinamika mitochondrial. Ankoatra izany, ireo angon-drakitra ireo dia manasongadina ny fampiasana teknika fakana sary mba handinihana mivantana ny fiovan'ny toetry ny farany amin'ny fiasan'ny mitochondrial.
Tsy niova ny haavon'ny proteinina fusion sy fission factor taorian'ny fitsaboana asidra propionic (PPA). Notsaboina tamin'ny PPA 3 sy 5 mM nandritra ny 24 ora ny sela SH-SY5Y. Norefesina tamin'ny alàlan'ny fanadihadiana Western blot ny haavon'ny proteinina, ary naverina tamin'ny proteinina manontolo ny haavon'ny fanehoana. Aseho eto ny fanehoana proteinina antonony sy ny Western blots maneho ny proteinina kendrena sy ny proteinina manontolo. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Ny bara dia maneho ny salan'isa ± SEM, ary ny angon-drakitra aseho dia maneho ny n = 3 replicates biolojika. Natao tamin'ny alàlan'ny fanadihadiana tokana momba ny variance sy ny fitsapana Dunnett ny fampitahana maromaro (p < 0.05). Aseho ao amin'ny Sary S1 ny gel sy ny blot tany am-boalohany.
Ny tsy fahatomombanan'ny mitochondria dia mifandray amin'ny aretina maro samihafa manomboka amin'ny aretina metabolika, aretim-po ary hozatra ka hatramin'ny aretina neurolojika1,10. Maro amin'ireo aretina neurodegenerative sy neurodegenerative no mifandray amin'ny tsy fahatomombanan'ny mitochondria, izay manasongadina ny maha-zava-dehibe ireo organelles ireo mandritra ny androm-piainan'ny atidoha. Ireo aretina ireo dia ahitana ny aretin'i Parkinson, ny aretin'i Alzheimer ary ny ASD3,4,18. Na izany aza, sarotra ny miditra amin'ny sela ao amin'ny atidoha mba handinihana ireo aretina ireo, indrindra amin'ny ambaratonga mekanika, ka mahatonga ny rafitra modely sela ho safidy ilaina. Ato amin'ity fandalinana ity, dia mampiasa rafitra modely sela izahay mampiasa sela SH-SY5Y voatsabo amin'ny PPA mba hamerenana ny tsy fahatomombanan'ny mitochondria hita amin'ny aretin'ny neuronal, indrindra fa ny fikorontanan'ny autism spectrum. Ny fampiasana ity modely PPA ity handinihana ny dinamikan'ny mitochondria ao amin'ny neurons dia mety hanome fahatakarana ny antony mahatonga ny ASD.
Nodinihinay ny mety hampiasana ny TEM mba hijerena ny fiovan'ny morphology mitochondrial. Zava-dehibe ny manamarika fa tsy maintsy ampiasaina araka ny tokony ho izy ny TEM mba hampitomboana ny fahombiazany. Ny fanomanana ny cryo-specimens dia ahafahana miaro tsara kokoa ny rafitry ny neuronal amin'ny alàlan'ny fanamboarana ireo singa sela sy ny fampihenana ny fiforonan'ny artifacts34. Mifanaraka amin'izany, dia hitanay fa ny sela SH-SY5Y mitovy amin'ny neuron dia nanana organelles subcellular tsy simba sy mitochondria lava (Sary 1a). Izany dia manasongadina ny fampiasana ny teknika fanomanana cryogenic ho an'ny fandalinana ny morphology mitochondrial amin'ny modely sela neuronal. Na dia tena ilaina aza ny fandrefesana quantitative amin'ny famakafakana tanjona ny angon-drakitra TEM, dia mbola tsy misy marimaritra iraisana momba ny hoe inona avy ireo masontsivana manokana tokony horefesina mba hanamafisana ny fiovan'ny morphology mitochondrial. Mifototra amin'ny fanadihadiana maro izay nandinika ny morphology mitochondrial amin'ny quantitative17,31,32, dia namorona fantsona famakafakana sary mitochondrial mandeha ho azy izahay izay mandrefy masontsivana morphological valo, dia ny: velarantany, velarantany2, tahan'ny lafiny, perimeter, circularity, degre, savaivony Feret. ary boribory.
Anisan'izany, ny PPA dia nampihena be ny faritra 2, ny velarany, ny perimetery, ary ny savaivony Feret (Sary 1b–e). Izany dia nampiseho fa nihakely sy nihabobo kokoa ny mitochondria, izay mifanaraka amin'ny fanadihadiana teo aloha izay naneho fihenan'ny velaran'ny mitochondria taorian'ny 72 ora nisian'ny fihenjanana mitochondrial vokatry ny PPA30. Ireo endri-javatra ara-morfolojika ireo dia mety manondro ny fission mitochondrial, dingana ilaina mba hanesorana ireo singa simba avy amin'ny tambajotra mitochondrial mba hampiroboroboana ny fahasimbany amin'ny alàlan'ny mitophagy35,36,37. Etsy ankilany, ny fihenan'ny haben'ny mitochondrial antonony dia mety mifandray amin'ny fitomboan'ny biogenesis, izay miteraka fiforonan'ny mitochondria kely vao misondrotra. Ny fitomboan'ny fission na biogenesis dia maneho valinteny fanonerana mba hihazonana ny mitosis manohitra ny fihenjanana mitochondrial. Na izany aza, ny fihenan'ny fitomboan'ny mitochondrial, ny fusion tsy mahomby, na ny toe-javatra hafa dia tsy azo esorina.
Na dia mamela ny famaritana ny toetra ara-morfolojika amin'ny ambaratongan'ny mitochondria tsirairay aza ny sary avo lenta noforonin'ny TEM, ity fomba ity dia mamokatra sary roa refy amin'ny fotoana iray. Mba handinihana ny valinteny dinamika amin'ny adin-tsaina metabolika, dia nolokoinay tamin'ny TMRE ny mitochondria ary nampiasa mikroskopia time-lapse miaraka amin'ny fanadihadiana MEL, izay ahafahana mijery 3D avo lenta ny fiovana ao amin'ny tambajotra mitochondria rehefa mandeha ny fotoana33,38. Nahita fiovana kely nefa manan-danja teo amin'ny dinamikan'ny mitochondria teo ambanin'ny adin-tsaina PPA izahay (Sary 2). Tamin'ny 3 mM, nitombo be ny isan'ny fission, raha nitovy tamin'ny an'ny fanaraha-maso kosa ny fission. Nitombo ny isan'ny fission sy fusion tamin'ny 5 mM PPA, saingy mitovy amin'ny an'ny fanaraha-maso ireo fiovana ireo, izay manondro fa mahatratra ny fifandanjana amin'ny fifantohana ambony kokoa ny fission sy ny fusion kinetics (Sary 2b). Tsy niova ny salan'isa amin'ny haben'ny mitochondria amin'ny 3 sy 5 mM PPA, izay manondro fa voatahiry ny fahamarinan'ny tambajotra mitochondria (Sary 2d). Izany dia maneho ny fahafahan'ny tambajotra mitochondria dinamika mamaly ny adin-tsaina metabolika malefaka mba hihazonana ny homeostasis tsy hiteraka fizarazarana ny tambajotra. Amin'ny 3 mM PPA, ny fitomboan'ny fission dia ampy hampiroboroboana ny fifindrana mankany amin'ny fifandanjana vaovao, saingy ilaina ny fanavaozana kinetika lalina kokoa ho setrin'ny adin-tsaina ateraky ny fifantohana ambony kokoa amin'ny PPA.
Nitombo ny isan'ny mitochondria tamin'ny fifantohana roa tamin'ny fihenjanana PPA, saingy tsy niova be ny salan'isa amin'ny haben'ny mitochondria (Sary 2c). Mety ho vokatry ny fitomboan'ny biogenesis na ny fitomboan'ny fizarana izany; na izany aza, raha tsy misy fihenana be amin'ny salan'isa amin'ny haben'ny mitochondria, dia azo inoana kokoa fa mitombo ny biosynthesis. Na izany aza, ny angon-drakitra ao amin'ny Sary 2 dia manohana ny fisian'ny mekanisma fanonerana roa: fitomboan'ny isan'ny trangan-javatra fission, mifanaraka amin'ny fitomboan'ny fission mitochondria, ary fitomboan'ny isan'ny trangan-javatra, mifanaraka amin'ny biogenesis mitochondria. Amin'ny farany, ny fanonerana dinamika ho an'ny fihenjanana malefaka dia mety ahitana dingana miaraka amin'ny fission, fusion, biogenesis, ary mitophagy. Na dia efa nasehon'ireo mpanoratra teo aloha aza fa ny PPA dia manatsara ny mitosis30,39 sy mitophagy29, dia manome porofo izahay ho an'ny fanavaozana ny fission mitochondria sy ny dinamikan'ny fusion ho setrin'ny PPA. Ireo angon-drakitra ireo dia manamafy ny fiovana morphological hitan'ny TEM ary manome fahatakarana bebe kokoa momba ny mekanisma mifandraika amin'ny tsy fahatomombanan'ny mitochondria vokatry ny PPA.
Satria tsy nanome porofo mivantana momba ny mekanisma mifehy ny fototarazo fototry ny fiovana ara-morfolojika hita ny fanadihadiana TEM na MEL, dia nodinihinay ny fanehoana RNA an'ireo fototarazo tafiditra amin'ny metabolisma mitochondria, biogenesis, ary dinamika. Ny proto-oncogene cMYC dia singa fandikana tafiditra amin'ny fandrindrana ny metabolisma mitochondria, glycolysis, asidra amine ary asidra matavy40. Ankoatra izany, ny cMYC dia fantatra fa mandrindra ny fanehoana ireo fototarazo mitochondria efa ho 600 tafiditra amin'ny fandikana, fandikan-teny ary fivorian'ny saro-takarina mitochondria, anisan'izany ny NRF1 sy TFAM41. Ny NRF1 sy TFAM dia mpandrindra foibe roa amin'ny mitosis, miasa any ambanin'ny PGC-1α mba hampandeha ny famerenana mtDNA. Ity lalana ity dia miasa amin'ny alàlan'ny famantarana cAMP sy AMPK ary mora tohina amin'ny fandaniana angovo sy ny adin-tsaina metabolika. Nodinihinay ihany koa ny NFE2L2, mpandrindra redox amin'ny biogenesis mitochondria, mba hamaritana raha mety ho vokatry ny adin-tsaina oksidativa ny vokatry ny PPA.
Na dia tsy niova aza ny fanehoana NFE2L2, dia nahita fihenana miankina amin'ny fatra tsy tapaka amin'ny fanehoana cMYC, NRF1 ary TFAM izahay taorian'ny fitsaboana 24 ora tamin'ny PPA 3 mM sy 5 mM (Sary 3a–c). Ny fihenan'ny fanehoana cMYC dia efa voalaza teo aloha ho valin'ny adin-tsaina mitochondrial42, ary mifanohitra amin'izany, ny fihenan'ny fanehoana cMYC dia mety hiteraka tsy fahatomombanan'ny mitochondrial amin'ny alàlan'ny fanavaozana ny metabolisman'ny mitochondrial, ny fifandraisana amin'ny tambajotra, ary ny polarization membrane43. Mahaliana fa ny cMYC koa dia mandray anjara amin'ny fandrindrana ny fission sy fusion mitochondrial42,43 ary fantatra fa mampitombo ny phosphorylation DRP1 sy ny toerana misy ny mitochondrial mandritra ny fizarazarana sela44, ary koa manelanelana ny fanavaozana morphological mitochondrial ao amin'ny sela fototra neuronal45. Eny tokoa, ny fibroblasts tsy ampy cMYC dia mampiseho haben'ny mitochondrial mihena, mifanaraka amin'ny fiovana vokatry ny adin-tsaina PPA43. Ireo angon-drakitra ireo dia mampiseho fifandraisana mahaliana nefa mbola tsy mazava eo amin'ny cMYC sy ny dinamikan'ny mitochondrial, izay manome tanjona mahaliana ho an'ny fandalinana amin'ny ho avy momba ny fanavaozana vokatry ny adin-tsaina PPA.
Mifanaraka amin'ny anjara asan'ny cMYC amin'ny maha-mpandrindra ny fandikana manan-danja azy ny fihenan'ny NRF1 sy TFAM. Mifanaraka amin'ny fanadihadiana teo aloha momba ny sela homamiadan'ny tsinaibe olombelona ihany koa ireo angon-drakitra ireo izay mampiseho fa nampihena ny fanehoana mRNA NRF1 tamin'ny 22 ora ny PPA, izay mifandray amin'ny fihenan'ny ATP sy ny fitomboan'ny ROS46. Ireo mpanoratra ireo koa dia nitatitra fa nitombo ny fanehoana TFAM tamin'ny 8.5 ora saingy niverina tamin'ny ambaratonga fototra tamin'ny 22 ora. Mifanohitra amin'izany, Kim et al. (2019) dia naneho fa nihena be ny fanehoana mRNA TFAM taorian'ny 4 ora nisian'ny PPA tao amin'ny sela SH-SY5Y; na izany aza, taorian'ny 72 ora, nitombo be ny fanehoana proteinina TFAM ary nitombo be ny isan'ny kopian'ny mtDNA. Noho izany, ny fihenan'ny isan'ny fototarazo biogenesis mitochondrial izay hitanay taorian'ny 24 ora dia tsy manilika ny mety hisian'ny fitomboan'ny isan'ny mitochondria mifandray amin'ny fampahavitrihana ny biogenesis amin'ny fotoana teo aloha. Ny fanadihadiana teo aloha dia naneho fa ny PPA dia mampitombo be ny PGC-1α mRNA sy proteinina ao amin'ny sela SH-SY5Y amin'ny 4 ora sy 30 minitra, raha toa kosa ny asidra propionic dia manatsara ny biogenesis mitochondrial ao amin'ny hepatocytes zanak'omby amin'ny alàlan'ny PGC-1α amin'ny 12 ora sy 39 minitra. Mahaliana fa ny PGC-1α dia tsy mpandrindra mivantana ny transcription an'ny NRF1 sy TFAM fotsiny, fa naseho ihany koa fa mandrindra ny asan'ny MFN2 sy DRP1 amin'ny alàlan'ny fanaraha-maso ny fission sy fusion47. Raha fintinina, ity dia manasongadina ny fifandraisana akaiky eo amin'ny mekanisma mandrindra ny valinteny fanonerana mitochondrial vokatry ny PPA. Ankoatra izany, ny angon-drakitray dia maneho ny tsy fahatomombanana manan-danja amin'ny fanaraha-maso ny transcription an'ny biogenesis sy ny metabolisma eo ambany fihenjanana PPA.
Anisan'ireo mpandrindra foibe ny fission, fusion ary dynamics mitochondrial ny gène STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 ary DRP137,48,49. Misy gène maro hafa tafiditra amin'ny dinamikan'ny mitochondrial, na izany aza, ny STOML2, OPA1 ary MFN2 dia efa hita fa samy hafa ny methylation-ny ao amin'ny cohort ASD,16 ary fanadihadiana mahaleo tena maromaro no nitatitra ny fiovan'ireo singa transcription ireo ho setrin'ny adin-tsaina mitochondrial50,51.52. Nihena be ny fanehoan'ny OPA1 sy STOML2 tamin'ny fitsaboana PPA 3 mM sy 5 mM (Sary 3e, f). Ny OPA1 dia iray amin'ireo mpandrindra mahazatra ny fusion mitochondrial amin'ny alàlan'ny fifandraisana mivantana amin'ny MFN1 sy 2 ary mitana anjara toerana amin'ny fanavaozana ny cristae sy ny morphology mitochondrial53. Mbola tsy mazava ny anjara asan'ny STOML2 amin'ny dinamikan'ny mitochondrial, saingy misy porofo milaza fa mitana anjara toerana amin'ny fusion mitochondrial, biogenesis, ary mitophagy izy.
Ny STOML2 dia tafiditra amin'ny fitazonana ny fifandraisan'ny taovam-pisefoana mitochondria sy ny fiforonan'ny complexes rojo taovam-pisefoana54,55 ary hita fa manova tanteraka ny toetran'ny metabolisman'ny sela homamiadana56. Ny fanadihadiana dia naneho fa ny STOML2 dia mampiroborobo ny mety ho vitan'ny membrane mitochondria sy ny biogenesis amin'ny alàlan'ny fifandraisana amin'ny BAN sy cardiolipin 55, 57, 58. Fanampin'izany, ny fanadihadiana tsy miankina dia naneho fa ny fifandraisana misy eo amin'ny STOML2 sy PINK1 dia mandrindra ny mitophagy59,60. Tsara homarihina fa ny STOML2 dia voalaza fa mifandray mivantana amin'ny MFN2 ary manamafy orina ary mitana anjara toerana lehibe amin'ny fanamafisana ny isoforms OPA1 lava amin'ny alàlan'ny fanakanana ny protease tompon'andraikitra amin'ny fahasimban'ny OPA153,61,62. Ny fihenan'ny fanehoana STOML2 hita amin'ny fihetsiky ny PPA dia mety hahatonga ireo proteinina fusion ireo ho mora simba kokoa amin'ny alàlan'ny lalan-kizorana miankina amin'ny ubiquitin sy proteasome48. Na dia tsy mazava aza ny anjara asan'ny STOML2 sy OPA1 amin'ny fihetsika mavitrika amin'ny PPA, ny fihenan'ny fanehoan'ireo fototarazo fusion ireo (Sary 3) dia mety hanakorontana ny fifandanjana eo amin'ny fission sy ny fusion ary hitarika amin'ny fihenan'ny haben'ny mitochondria (Sary 3). 1).
Etsy ankilany, tsy niova ny fanehoana ny proteinina OPA1 rehefa afaka 24 ora, raha toa kosa ka tsy niova firy ny haavon'ny mRNA sy ny proteinina ao amin'ny MFN1, MFN2 na DRP1 taorian'ny fitsaboana PPA (Sary 3g-i, Sary 4). Mety hidika izany fa tsy misy fiovana eo amin'ny fandrindrana ireo anton-javatra tafiditra amin'ny fusion sy fission mitochondrial. Na izany aza, tsara homarihina fa ny tsirairay amin'ireo fototarazo efatra ireo dia fehezin'ny fanovana posttranscriptional (PTM) izay mifehy ny asan'ny proteinina. Ny OPA1 dia manana variana splice hafa valo izay voazarazara proteolytically ao amin'ny mitochondria mba hamokatra isoforms roa miavaka 63. Ny fifandanjana eo amin'ny isoforms lava sy fohy dia mamaritra ny anjara asan'ny OPA1 amin'ny fusion mitochondrial sy ny fitazonana ny tambajotra mitochondrial64. Ny asan'ny DRP1 dia fehezin'ny phosphorylation calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII), raha toa kosa ny fahasimban'ny DRP1 dia fehezin'ny ubiquitination sy SUMOylation65. Farany, samy GTPase ny DRP1 sy ny MFN1/2, ka mety hisy fiantraikany amin'ny tahan'ny famokarana GTP ao amin'ny mitochondria 66 ny asa. Noho izany, na dia mijanona ho tsy miova aza ny fanehoan'ireo proteinina ireo, dia mety tsy haneho ny fiasan'ny proteinina na ny toerana misy azy izany67,68. Eny tokoa, ny repertoire proteinina PTM efa misy dia matetika no fiarovana voalohany tompon'andraikitra amin'ny fanelanelanana ny valin'ny adin-tsaina tampoka. Raha misy adin-tsaina metabolika antonony ao amin'ny modely misy anay, dia azo inoana fa ny PTM dia mampiroborobo ny fitomboan'ny asan'ny proteinina fusion sy fission mba hamerenana amin'ny laoniny ny fahamarinan'ny mitochondria tsy mila fampandehanana fanampiny ireo fototarazo ireo amin'ny ambaratonga mRNA na proteinina.
Raha fintinina, ireo angon-drakitra etsy ambony ireo dia manasongadina ny fitsipika sarotra sy miankina amin'ny fotoana eo amin'ny morphology mitochondrial ary ireo fanamby amin'ny fanazavana ireo mekanisma ireo. Mba handinihana ny fanehoana ny fototarazo, dia ilaina aloha ny mamantatra ireo fototarazo kendrena manokana ao amin'ny lalana. Na izany aza, ny angon-drakitray dia mampiseho fa ny fototarazo ao amin'ny lalana iray ihany dia tsy mamaly amin'ny fomba mitovy amin'ny adin-tsaina mitovy. Raha ny marina, ny fanadihadiana teo aloha dia naneho fa ny fototarazo samihafa ao amin'ny lalana iray ihany dia mety haneho mombamomba ny valinteny ara-potoana samihafa30,46. Ankoatra izany, misy mekanisma sarotra aorian'ny fandikana izay manakorontana ny fifandraisana misy eo amin'ny fandikana sy ny asan'ny fototarazo. Ny fanadihadiana proteomika dia afaka manome fahatakarana ny fiantraikan'ny PTM sy ny asan'ny proteinina, saingy miteraka fanamby ihany koa izy ireo anisan'izany ny fomba ambany, ny tahan'ny signal-to-noise avo lenta, ary ny famaha olana ambany.
Amin'ity toe-javatra ity, ny fandalinana ny morphology mitochondrial amin'ny fampiasana TEM sy MEL dia manana fahafahana lehibe hamaliana ireo fanontaniana fototra momba ny fifandraisana misy eo amin'ny dinamika sy ny fiasan'ny mitochondrial ary ny fiantraikan'izany amin'ny aretina. Ny tena zava-dehibe dia ny TEM dia manome fomba mivantana handrefesana ny morphology mitochondrial ho toy ny teboka ifantohan'ny tsy fahatomombanan'ny mitochondrial sy ny dinamika51. Ny MEL koa dia manome fomba mivantana hijerena ny fisehoan-javatra fission sy fusion ao anatin'ny tontolo sela telo dimensions, ahafahana mandrefy ny fanavaozana mitochondrial dinamika na dia tsy misy fiovana eo amin'ny fanehoan-kevitra momba ny fototarazo aza33. Eto izahay dia manasongadina ny fampiasana teknika sary mitochondrial amin'ny aretina mitochondrial faharoa. Ireo aretina ireo dia matetika miavaka amin'ny adin-tsaina metabolika malemy mitaiza izay miavaka amin'ny fanavaozana malefaka ny tambajotra mitochondrial fa tsy ny fahasimban'ny mitochondrial tampoka. Na izany aza, ny fanonerana mitochondrial ilaina mba hitazonana ny mitosis eo ambanin'ny adin-tsaina mitaiza dia misy fiantraikany lalina amin'ny fiasa. Ao anatin'ny sehatry ny neuroscience, ny fahatakarana tsara kokoa ireo mekanisma fanonerana ireo dia mety hanome fampahalalana manan-danja momba ny neuropathologie pleiotropic mifandraika amin'ny tsy fahatomombanan'ny mitochondrial.
Farany, ny angon-drakitray dia manasongadina ny maha-ilaina ny teknika fakana sary mba hahatakarana ny vokatry ny fifandraisana sarotra eo amin'ny fanehoana ny fototarazo, ny fanovana ny proteinina, ary ny asan'ny proteinina izay mifehy ny dinamikan'ny mitochondria neuronal. Nampiasa PPA izahay mba hanaovana modely ny tsy fahombiazan'ny mitochondria ao amin'ny modely sela neuronal mba hahazoana fahatakarana ny singa mitochondria amin'ny ASD. Ny sela SH-SY5Y notsaboina tamin'ny PPA dia naneho fiovana teo amin'ny morphology mitochondria: nanjary kely sy boribory ny mitochondria, ary tsy voafaritra tsara ny cristae rehefa nojerena tamin'ny TEM. Ny fanadihadiana MEL dia mampiseho fa ireo fiovana ireo dia mitranga miaraka amin'ny fitomboan'ny fission sy fusion mba hitazonana ny tambajotra mitochondria ho setrin'ny adin-tsaina metabolika malefaka. Ankoatra izany, ny PPA dia manakorontana be ny fandrindrana ny transcription an'ny metabolisma sy ny homeostasis mitochondria. Namantatra ny cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, ary OPA1 ho mpandrindra mitochondria lehibe izay nosimban'ny adin-tsaina PPA izahay ary mety mitana anjara toerana amin'ny fanelanelanana ny fiovana ateraky ny PPA amin'ny morphology sy ny asan'ny mitochondria. Ilaina ny fanadihadiana amin'ny ho avy mba hamaritana tsara kokoa ny fiovana ara-potoana ateraky ny PPA amin'ny fanehoana ny fototarazo sy ny asan'ny proteinina, ny toerana misy azy, ary ny fanovana aorian'ny fandikan-teny. Asongadin'ny angon-drakitray ny fahasarotana sy ny fifampiankinan'ireo mekanisma mifehy izay manelanelana ny fiatrehana ny fihenjanana mitochondria ary mampiseho ny maha-ilaina ny TEM sy ny teknika fakana sary hafa ho an'ny fanadihadiana mekanistika mikendry kokoa.
Novidina avy amin'ny Sigma-Aldrich ny andian-sela SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL). Novolena tao amin'ny fangaro otrikaina Dulbecco's modified Eagle's medium/F-12 (DMEM/F-12) sy L-glutamine (SC09411, ScienCell) tao anaty tavoara 25 cm2 nasiana sérum bovine fetal 20% (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) sy penicillin-streptomycin 1% (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) tamin'ny 37 °C, 5% CO2 ny sela SH-SY5Y. Novolena tamin'ny alalan'ny fampiasana trypsin-EDTA 0.05% (15400054, ThermoFisher Scientific) mba hahazoana 80% ny fitambaran'ny sela, notsintrifugasi tamin'ny 300 g ary nopetahana takelaka tamin'ny hakitroky ny sela 7 × 105/ml eo ho eo. Natao tamin'ny sela SH-SY5Y tsy mbola niovaova ny andrana rehetra teo anelanelan'ny andalana 19–22. Ampiasaina amin'ny endrika NaP ny PPA. Arotsaho ao anaty rano MilliQ mafana ny vovoka NaP (CAS No. 137-40-6, raikipohy simika C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) mandra-pahatonga azy ho 1 M ny fifantohana ary tehirizo amin'ny 4 °C. Amin'ny andro fitsaboana, afangaro amin'ny 1 M PPA ity vahaolana ity amin'ny 3 mM sy 5 mM PPA ao anaty rano tsy misy serum (DMEM/F-12 misy L-glutamine). Tsy nisy PPA ny fifantohana fitsaboana ho an'ny andrana rehetra (0 mM, fanaraha-maso), 3 mM, ary 5 mM PPA. Natao tamin'ny famerimberenana biolojika telo farafahakeliny ny andrana.
Nafafy tao anaty tavoara 25 cm5 tamin'ny tahan'ny sela 5.5 × 105/ml ny sela SH-SY5Y ary notezaina nandritra ny 24 ora. Nampiana tao anaty tavoara ny fitsaboana PPA talohan'ny 24 ora niompiana. Angony ny pellets sela araka ny fomba fambolena sela mahazatra amin'ny biby mampinono (voalaza etsy ambony). Avereno ampangotrahina ao anaty 100 µl glutaraldehyde 2.5%, 1× PBS ny pellet sela ary tehirizina amin'ny 4 °C mandra-pahatongan'ny fanodinana. Notsindrina vetivety ny sela SH-SY5Y mba hampangotrahana ny sela ary hanesorana ny vahaolana glutaraldehyde 2.5%, 1× PBS. Avereno ampangotrahina ao anaty gel agarose 4% voaomana amin'ny rano voadio ny sediment (ny tahan'ny agarose amin'ny haben'ny sediment dia 1:1). Napetraka teo amin'ny grids teo amin'ny takelaka fisaka ny sombin-javatra agarose ary norakofana 1-hexadecene talohan'ny fampangatsiahana amin'ny tsindry avo. Nangatsiaka tao anaty acetone maina 100% tamin'ny -90°C nandritra ny 24 ora ny santionany. Avy eo dia nampiakarina ho -80°C ny mari-pana ary nampiana vahaolana misy osmium tetroxide 1% sy glutaraldehyde 0.1%. Notehirizina tamin'ny -80°C nandritra ny 24 ora ny santionany. Taorian'izany, dia nampiakarina tsikelikely ho amin'ny mari-pana ao an-trano nandritra ny andro maromaro ny mari-pana: avy amin'ny – 80 °C ka hatramin'ny – 50 °C mandritra ny 24 ora, ho amin'ny – 30 °C mandritra ny 24 ora, ho amin'ny – 10 °C mandritra ny 24 ora ary farany ho amin'ny mari-pana ao an-trano.
Taorian'ny fanomanana tamin'ny alalan'ny cryogenika, dia nototoina tamin'ny resin ireo santionany ary natao tamin'ny alalan'ny Leica Reichert UltracutS ultramicrotome (Leica Microsystems) ireo fizarana manify dia manify (∼100 nm). Nolokoina tamin'ny uranyl acetate 2% sy firaka citrate ireo fizarana. Nojerena tamin'ny alalan'ny mikraoskaopy elektrôna fandefasana FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (FEI taloha), Eindhoven, Holandy) miasa amin'ny 200 kV (mpandefa Lab6) sy fakantsary Gatan CCD (Gatan, UK) misy sivana angovo Tridiem ireo santionany.
Tao anatin'ny famerenana ara-teknika tsirairay, sary sela tokana farafahakeliny 24 no azo, ka nahatratra sary 266 ny fitambarany. Nohadihadiana avokoa ny sary rehetra tamin'ny fampiasana ny macro Region of Interest (ROI) sy ny macro Mitochondria. Ny macro mitochondria dia mifototra amin'ny fomba navoaka17,31,32 ary mamela ny fanodinana batch semi-automatique ny sary TEM ao amin'ny Fiji/ImageJ69. Raha fintinina: avadika sy avadika ny sary amin'ny fampiasana ny fanesorana ny background ball rolling (radius 60 pixel) sy ny sivana FFT bandpass (mampiasa fetra ambony sy ambany 60 sy 8 pixel tsirairay avy) ary ny fampihenana ny tsipika mitsangana miaraka amin'ny fandeferana ny fironana 5%. Ny sary voahodina dia ferana ho azy amin'ny fampiasana algorithm entropy ambony indrindra ary misy saron-tava binary noforonina. Nalaina ireo faritra sary mifandraika amin'ny ROI voafantina tanana amin'ny sary TEM manta, mampiavaka ny mitochondria ary manilika ny fonon'ny plasma sy ireo faritra mifanohitra avo hafa. Ho an'ny ROI tsirairay nalaina, dia nohadihadiana ireo singa binary lehibe kokoa noho ny 600 piksela, ary norefesina tamin'ny alalan'ny fampiasana ny asa fandrefesana efa tafiditra ao amin'ny Fiji/ImageJ ny velaran'ny singa, ny perimeter, ny axe lehibe sy madinika, ny savaivony Feret, ny faribolana, ary ny faribolana. Manaraka an'i Merrill, Flippo, ary Strack (2017), dia nokajiana avy amin'ireo angon-drakitra ireo ny velaran-tany 2, ny tahan'ny lafiny singa (tahan'ny axe lehibe amin'ny axe madinika), ary ny anton-javatra endrika (FF), izay ahitana ny FF = perimeter 2/4pi x velaran-tany. Ny famaritana ny raikipohy parametrika dia hita ao amin'ny Merrill, Flippo, ary Strack (2017). Ireo macro voalaza ireo dia azo jerena ao amin'ny GitHub (jereo ny Fanambarana momba ny Fahafaha-miditra amin'ny Angon-drakitra). Amin'ny ankapobeny, singa eo amin'ny 5.600 eo ho eo no nohadihadiana isaky ny fitsaboana PPA, izay mitentina singa eo amin'ny 17.000 eo ho eo (tsy aseho ny angon-drakitra).
Napetraka tao anaty lovia fambolena misy efitra 8 (ThermoFisher, #155411) ireo sela SH-SH5Y mba hahafahana miraikitra mandritra ny alina ary avy eo dia notehirizina tamin'ny TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) sy Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Nalaina tamin'ny alalan'ny laser 405 nm sy 561 nm nandritra ny 10 minitra ny sary, ary nalaina tamin'ny endrika z-stacks misy mikrôgrafia sary 10 miaraka amin'ny dingana az 0.2 μm eo anelanelan'ny frame sary amin'ny fotoana 12 manaraka ny sary. Nangonina tamin'ny alalan'ny sehatra super-resolution Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemaina) ny sary tamin'ny alalan'ny family LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Nohadihadiana tao amin'ny ImageJ ireo sary tamin'ny fampiasana ny pipeline efa voalaza teo aloha sy ny plugin ImageJ mba handrefesana ny hetsika fusion sy fission, ny salan'isan'ny rafitra mitochondrial, ary ny salan'isan'ny volume mitochondrial isaky ny sela33. Azo jerena ao amin'ny GitHub ny macros MEL (jereo ny Data Availability Statement).
Nobeazina tao anaty takelaka misy lavaka enina ny sela SH-SY5Y tamin'ny hakitroky ny sela 0.3 × 106/mL nandritra ny 24 ora talohan'ny fitsaboana. Nalaina ny RNA tamin'ny alàlan'ny protocole Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) miaraka amin'ny fanovana kely: ampio 300 μl ny buffer lysis RNA amin'ny lavaka tsirairay alohan'ny hanesorana azy ary lyse ny santionany tsirairay ho dingana farany amin'ny rano tsy misy DNase/RNase 30 μl. Nojerena ny habetsahana sy ny kalitaon'ny santionany rehetra tamin'ny alàlan'ny NanoDrop ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer. Ny proteinina manontolo avy amin'ny lysate sela dia azo tamin'ny alàlan'ny buffer lysis RIPA 200 μl, ary ny fifantohan'ny proteinina dia norefesina tamin'ny alàlan'ny Bradford protein assay70.
Natao tamin'ny alalan'ny Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) ny fananganana cDNA araka ny torolalan'ny mpanamboatra miaraka amin'ny fanovana sasany. Noforonina tamin'ny alalan'ny fihetsika 20-μl ny cDNA tamin'ny alalan'ny fampiasana 0.7 hatramin'ny 1 μg amin'ny ARN manontolo. Nofantenana avy amin'ireo lahatsoratra efa navoaka teo aloha 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tabilao S1) ireo "primers" ary novolavolaina tamin'ny alalan'ny fitaovana PrimerQuest avy amin'ny Integrated DNA Technologies ireo "probes" miaraka aminy. Namboarina ho "gene" B2M nokleary avokoa ireo fototarazo rehetra mahaliana. Norefesina tamin'ny alalan'ny RT-qPCR ny fanehoana ny fototarazon'ny STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC ary OPA1. Ny fangaro fototra dia nahitana ny LUNA Taq polymerase (M3003L, New England Biolabs), 10 μM forward and reverse primers, cDNA, ary rano PCR-grade mba hahazoana volume farany 10 μL ho an'ny fihetsika tsirairay. Ny fanehoana ny fototarazo fizarana sy fission (DRP1, MFN1/2) dia norefesina tamin'ny fampiasana ny TaqMan multiplex assays. Ny Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) dia nampiasaina araka ny torolalan'ny mpanamboatra miaraka amin'ny fanovana kely. Ny multiplex RT-qPCR master mix dia nahitana ny 1X LUNA Taq polymerase, 10 μM forward and reverse primers, 10 μM probe, cDNA, ary rano PCR-grade, ka nahatonga ny volume farany 20 μL ho an'ny fihetsika tsirairay. Ny RT-qPCR dia natao tamin'ny fampiasana ny Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—laharana serial: R0618110). Ny fepetra momba ny tsingerina dia aseho ao amin'ny Tabilao S1. Nohamafisina intelo ny santionan'ny cDNA rehetra ary noforonina ny fiolahana mahazatra tamin'ny fampiasana andiana fanalefahana folo heny. Nesorina tamin'ny fanadihadiana ireo outliers amin'ny santionany intelo miaraka amin'ny fivilian-dàlana mahazatra (Ct) >0.5 mba hahazoana antoka fa azo averina ny angona30,72. Nokajiana tamin'ny fampiasana ny fomba 2-ΔΔCt79 ny fanehoana ny fototarazo mifandraika.
Nafangaro tamin'ny Laemmli loading buffer tamin'ny tahan'ny 2:1 ny santionan'ny proteinina (60 μg) ary nampiasaina tamin'ny gel proteinina tsy misy loko 12% (Bio-Rad #1610184). Nafindra tao amin'ny fonon'ny PVDF (polyvinylidene fluoride) (#170-84156, Bio-Rad) ny proteinina tamin'ny fampiasana ny rafitra Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Nosakanana ny fonon'ny sela ary notehirizina niaraka tamin'ireo antibody voalohany mety (OPA1, MFN1, MFN2, ary DRP1) (nalevina 1:1000) nandritra ny 48 ora, narahin'ny fanetezam-boaloboka niaraka tamin'ireo antibody faharoa (1:10,000) nandritra ny 1 ora. Avy eo dia nalaina sary ireo fonon'ny sela tamin'ny fampiasana ny Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) ary noraketina an-tsoratra tamin'ny fampiasana ny rafitra Bio-Rad ChemiDoc MP. Nampiasaina tamin'ny fanadihadiana Western blot ny ImageLab version 6.1. Aseho amin'ny Sary S1 ny gel sy ny blot tany am-boalohany. Ny fampahalalana momba ny antikôra dia omena ao amin'ny Tabilao S2.
Aseho amin'ny salan'isa sy ny hadisoana mahazatra amin'ny salan'isa (SEM) farafahakeliny santionany telo mahaleo tena ny angon-drakitra. Notsapaina ny ara-dalàna tamin'ny fampiasana ny fitsapana Shapiro-Wilks (raha tsy voalaza manokana) ny angon-drakitra alohan'ny handraisana ny fizarana Gaussian sy ny fivilian-dàlana mahazatra mitovy ary hanohy ny fanadihadiana. Ho fanampin'ny famakafakana ny angon-drakitra amin'ny fampiasana ny Fisher's MEL LSD (p < 0.05), ny ANOVA tokana (salan'isa fitsaboana vs. fanaraha-maso), ary ny fitsapana fampitahana marobe an'i Dunnett mba hamaritana ny dikany (p < 0.05). Aseho amin'ny grafika ny sandan'ny p manan-danja amin'ny *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Natao sy novokarina tamin'ny fampiasana GraphPad Prism 9.4.0 ny fanadihadiana statistika sy ny grafika rehetra.
Azo jerena ampahibemaso ao amin'ny GitHub ny macro Fiji/ImageJ ho an'ny famakafakana sary TEM: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Azo jerena ampahibemaso ao amin'ny GitHub ny macro Mitochondrial Event Locator (MEL): https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM ary Vijaya A. Mitokondria: mpandrindra lehibe ny metabolisma, homeostasis, adin-tsaina, fahanterana ary epigenetika. Indoneziana. Siansa biomedika. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Tsy fahatomombanan'ny mitochondria amin'ny lafiny maro amin'ny skizofrenia, complex I ho toy ny lasibatra patholojika mety hitranga. Skizofrenia. loharano. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. sy Beal, MF. Tsy fahatomombanan'ny Mitokondria amin'ny aretin'i Parkinson. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG ary Mehta V. Mitochondria voatsindry: lasibatry ny fanafihana amin'ny aretin'i Alzheimer. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF sy Ferreira GK Mitokondria sy ny ati-doha: bioenergetika sy ny maro hafa. Neurotoxins. loharano. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Mitochondria pleiotropika: ny fiantraikan'ny mitochondria amin'ny fivoaran'ny neurona sy ny aretina. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. sy Morais, VA Biogenesis mitochondria ao amin'ny neurons: ny fomba sy ny toerana. iraisam-pirenena. J. Mohr. ny siansa. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. sy Zhao, J. Fitsipika momba ny dinamikan'ny mitochondria amin'ny biby mampinono: fahafahana sy fanamby. front. endocrine. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. sy Slack, RS Dinamika mitokondria amin'ny fandrindrana ny neurogenesis: manomboka amin'ny fivoaran'ny ati-doha ka hatramin'ny fivoaran'ny olon-dehibe. dinamika. 247, 47–53 (2018).