Ankehitriny *Adiresy ankehitriny: Cologne 50931, Alemaina, Fikarohana momba ny fiantraikan'ny adin-tsaina amin'ny sela amin'ny aretina mifandraika amin'ny fahanterana (CECAD) ao amin'ny vondrona Excellence Cluster ao Cologne.
Heverina ho tsy azo averina intsony ny fahasimban'ny ati-doha vokatry ny aretin'ny mitochondria satria voafetra ny fahafahan'ny sela mivelatra, saingy mbola tsy mazava tsara ny fiantraikan'ny tsy fahatomombanan'ny mitochondria amin'ny fizakan-tenan'ny sela amin'ny metabolisman'ny neurona ao amin'ny vatana. Eto izahay dia mampiditra ny proteome manokana ho an'ny sela ao amin'ny neurona Purkinje miaraka amin'ny tsy fahampian'ny OXPHOS miandalana vokatry ny fikorontanan'ny dinamikan'ny fusion mitochondria. Hitanay fa ny tsy fahatomombanan'ny mitochondria dia niteraka fiovana lalina teo amin'ny sehatry ny proteomics, izay nitarika ho amin'ny fampandehanana misesy ny fandaharan'asa metabolika marina alohan'ny hahafatesan'ny sela. Tsy nampoizina fa voafaritray ny fampidirana miharihary ny pyruvate carboxylase (PCx) sy ny anzima manohitra ny fahanterana hafa izay manampy ny mpanelanelana amin'ny tsingerin'ny TCA. Ny fanakanana ny PCx dia nanamafy ny adin-tsaina oksidativa sy ny neurodegeneration, izay manondro fa ny atherosclerosis dia misy fiantraikany miaro amin'ny neurona tsy manana OXPHOS. Ny famerenana amin'ny laoniny ny fusion mitochondria ao amin'ny neurona simba dia mamadika tanteraka ireo toetra metabolika ireo, ka misoroka ny fahafatesan'ny sela. Ny zavatra hitanay dia mamantatra ireo lalana tsy fantatra teo aloha izay manome faharetana amin'ny tsy fahatomombanan'ny mitochondria ary mampiseho fa ny neurodegeneration dia azo averina na dia amin'ny dingana farany amin'ny aretina aza.
Ny anjara toerana lehibe amin'ny mitochondria amin'ny fitazonana ny metabolisman'ny angovon'ny neurona dia hamafisin'ireo soritr'aretina ara-neurolojika miely patrana mifandraika amin'ny aretin'ny mitochondria olombelona. Ny ankamaroan'ireo aretina ireo dia vokatry ny fiovan'ny fototarazo izay mandrindra ny fanehoana ny fototarazo mitochondria (1, 2) na ny fandringanana fototarazo mifandraika amin'ny dinamikan'ny mitochondria, izay misy fiantraikany ankolaka amin'ny fahamarinan'ny ADN mitochondria (mtDNA) (3, 4). Ny asa natao tamin'ny modely biby dia naneho fa ho setrin'ny tsy fahatomombanan'ny mitochondria amin'ny sela manodidina, dia azo ampiasaina ny lalan'ny metabolika miaro (5-7), izay manome fampahalalana manan-danja ho an'ny fahatakarana lalina ny pathogenesis amin'ireo aretina sarotra ireo. Mifanohitra tanteraka amin'izany, ny fahatakarantsika ny fiovan'ny metabolika amin'ny karazana sela manokana vokatry ny tsy fahombiazan'ny famokarana adenosine triphosphate (ATP) mitochondria ao amin'ny atidoha dia fototra (8), izay manantitrantitra ny filàna mamantatra ireo tanjona fitsaboana izay azo ampiasaina hisorohana na hisorohana ny aretina. Misoroka ny neurodegeneration (9). Ny tsy fahampian'ny fampahalalana dia ny hoe heverina ho voafetra be ny fahafahan'ny sela nerveo miasa raha oharina amin'ny karazana sela manodidina (10). Koa satria ireo sela ireo dia mitana anjara toerana lehibe amin'ny fandrindrana ny famatsiana metabolites amin'ny neurons mba hampiroboroboana ny fifindran'ny synaptic sy hamaly ny ratra sy ny aretina, ny fahafahana mampifanaraka ny metabolisman'ny sela amin'ny toe-javatra sarotra ao amin'ny sela ao amin'ny atidoha dia saika voafetra amin'ny sela glial (11-14). Ankoatra izany, ny tsy fitoviana sela ao amin'ny sela ao amin'ny sela ao amin'ny atidoha dia manakana betsaka ny fandalinana ny fiovana metabolika izay mitranga amin'ny vondron'olona neuronal manokana. Vokatr'izany, tsy dia fantatra loatra ny vokatry ny tsy fahatomombanan'ny mitochondria ao amin'ny neurons amin'ny sela sy ny metabolika.
Mba hahatakarana ny voka-dratsin'ny tsy fahatomombanan'ny mitochondria amin'ny metabolisma, dia nanavaka ny Purkinje neurons (PNs) amin'ny dingana samihafa amin'ny neurodegeneration vokatry ny faharavan'ny mitochondria outer membrane fusion (Mfn2) izahay. Na dia mifandray amin'ny endrika neuropathie sensory motor nolovaina fantatra amin'ny anarana hoe Charcot-Marie-Tooth type 2A (15) aza ny fiovan'ny Mfn2 amin'ny olombelona, ​​ny faharavan'ny Mfn2 amin'ny totozy dia fomba fiasa fantatra tsara amin'ny induction of oxidation​​​ Phosphorylation (OXPHOS). Ny karazana neuronal isan-karazany (16-19) sy ny phenotype neurodegenerative vokatr'izany dia miaraka amin'ny soritr'aretina neurological miandalana, toy ny fikorontanan'ny fihetsehana (18, 19) na cerebellar ataxia (16). Amin'ny fampiasana fitambaran'ny label-free quantitative (LFQ) proteomics, metabolomics, imaging, ary fomba virolojika, dia asehonay fa ny neurodegeneration miandalana dia miteraka mafy ny pyruvate carboxylase (PCx) sy ireo anton-javatra hafa tafiditra amin'ny arteriosclerosis an'ny PNs in vivo Ny fanehoana ny anzima. Mba hanamarinana ny maha-zava-dehibe ity zavatra hita ity, dia nampihena manokana ny fanehoana ny PCx tao amin'ny PN tsy ampy Mfn2 izahay, ary nahita fa ity fandidiana ity dia nanamafy ny fihenjanana oksidativa sy nanafaingana ny fahasimban'ny atidoha, ka nanaporofo fa ny azoospermia dia manome ny fahafatesan'ny sela. Ny fanehoana mafy ny MFN2 dia afaka mamonjy tanteraka ny PN amin'ny fahasimbana farany miaraka amin'ny tsy fahampian'ny OXPHOS mafy, ny fanjifana be loatra ny ADN mitochondrial, ary ny tambajotra mitochondrial toa tapaka, izay manamafy bebe kokoa fa ity karazana fahasimban'ny atidoha ity dia afaka miverina amin'ny dingana mandroso amin'ny aretina alohan'ny hahafatesan'ny sela.
Mba hijerena ny mitochondria ao amin'ny Mfn2 knockout PNs, dia nampiasa karazana totozy izahay izay mamela ny mitochondria miankina amin'ny Cre hikendry ny fanehoana proteinina fluorescent mavo (YFP) (mtYFP) (20) Cre ary nanamarina ny morphology mitochondrial in vivo. Hitanay fa ny fandringanana ny gène Mfn2 ao amin'ny PNs dia hitarika amin'ny fizarazarana miandalana ny tambajotra mitochondrial (Sary S1A), ary ny fiovana voalohany indrindra dia hita tamin'ny 3 herinandro. Mifanohitra amin'izany, ny fahasimbana goavana amin'ny sosona sela PN, araka ny asehon'ny fahaverezan'ny Calbindin immunostaining, dia tsy nanomboka raha tsy tamin'ny 12 herinandro (Sary 1, A sy B). Ny tsy fitoviana ara-potoana teo amin'ny fiovana voalohany teo amin'ny morphology mitochondrial sy ny fiandohan'ny fahafatesan'ny neuronal hita maso dia nanosika anay hanadihady ny fiovana metabolika nateraky ny tsy fahatomombanan'ny mitochondrial talohan'ny fahafatesan'ny sela. Namolavola paikady mifototra amin'ny fluorescence-activated cell sorting (FACS) izahay mba hanasarahana ny PN maneho YFP (YFP+) (Sary 1C), ary amin'ny totozy fanaraha-maso (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), izay antsoina eto ambany hoe CTRL (Sary S1B). Ny fanatsarana ny paikady gating mifototra amin'ny hamafin'ny famantarana YFP dia ahafahanay manadio ny vatan'ny YFP+ (YFPhigh) amin'ny PN avy amin'ny tsy PN (YFPneg) (Sary S1B) na sombin-javatra fluorescent axon/dendritic mety ho hita (YFPlow; Sary S1D, havia), izay nohamafisin'ny mikroskopia confocal (Sary S1D, havanana). Mba hanamarinana ny maha-izy azy ny mponina voasokajy, dia nanao fanadihadiana momba ny proteomics LFQ izahay ary avy eo dia nanao fanadihadiana momba ny singa fototra, ary nahita fa misy fisarahana mazava eo amin'ny sela YFPhigh sy YFPneg (Sary S1C). Ny sela YFPhigh dia naneho fanatsarana ny mari-pamantarana PN fantatra (ohatra Calb1, Pcp2, Grid2 ary Itpr3) (21, 22), saingy tsy nisy fanatsarana ny proteinina izay matetika hita ao amin'ny neurons na karazana sela hafa (Sary 1D)). Ny fampitahana teo amin'ny santionany tao amin'ny sela YFPhigh voasokajy nangonina tamin'ny andrana mahaleo tena dia naneho coefficient correlation> 0.9, izay mampiseho ny fahafaha-mamerina tsara eo amin'ny replicates biolojika (Sary S1E). Raha fintinina, ireo angon-drakitra ireo dia nanamarina ny drafitray ho an'ny fanasarahana tampoka sy manokana ny PN azo atao. Satria ny rafitra mpamily L7-cre ampiasaina dia miteraka recombination mosaic amin'ny herinandro voalohany aorian'ny fiterahana (23), dia nanomboka nanala totozy avy amin'ny CTRL sy conditional (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Manangona neurons izahay. Rehefa vita ny recombination, dia antsoina hoe Mfn2cKO amin'ny 4 herinandro. Ho famaranana, nifidy 8 herinandro izahay rehefa tsy simba ny sosona PN na dia teo aza ny fisarahan'ny mitochondria miharihary (Sary 1B sy Sary S1A). Amin'ny ankapobeny, dia nandrefy proteinina miisa 3013 izahay, izay eo amin'ny 22% eo ho eo no mifototra amin'ny fanamarihana MitoCarta 2.0 mifototra amin'ny proteome mitochondria ho mitochondria (Sary 1E) (Sary 1E) (24). Ny fanadihadiana momba ny fanehoana ny fototarazo samihafa natao tamin'ny herinandro faha-8 dia naneho fa 10.5% amin'ny proteinina rehetra ihany no niova be (Sary 1F sy Sary S1F), izay proteinina 195 no nihena ary proteinina 120 no niakatra (Sary 1F). Tsara homarihina fa ny "fanadihadiana ny lalan-kizorana manavao" amin'ity angon-drakitra ity dia mampiseho fa ny fototarazo maneho ny fahasamihafana dia an'ny andiana lalan-kizorana metabolika manokana voafetra (Sary 1G). Mahaliana fa na dia manamafy ny firongatry ny tsy fahatomombanan'ny mitochondria amin'ny PN tsy ampy fusion aza ny fihenan'ny lalan-kizorana mifandraika amin'ny OXPHOS sy ny famantarana kalsioma, dia mitombo be ny tsy fahatomombanan'ny fiasan'ny mitochondria amin'ny sokajy hafa izay mahakasika indrindra ny metabolisman'ny asidra amine, izay mifanaraka amin'ny metabolisma izay mitranga amin'ny PN mitochondria.
(A) Sary confocal maneho ny fizarana cerebellar an'ny totozy CTRL sy Mfn2cKO izay mampiseho ny fahaverezan'ny PN miandalana (calbindin, volondavenona); nolokoina tamin'ny DAPI ny nokleary. (B) Fandrefesana ny (A) (fanadihadiana tokana momba ny fiovaovana, ***P<0.001; n = 4 hatramin'ny 6 faribolana avy amin'ny totozy telo). (C) Fomba fiasa fanandramana. (D) Fizarana sarintany hafanana amin'ny marika manokana ho an'ny Purkinje (ambony) sy ny karazana sela hafa (afovoany). (E) Kisarisary Venn mampiseho ny isan'ny proteinina mitochondrial hita ao amin'ny PN voasokajy. (F) Kisarisary volkano amin'ny proteinina maneho fahasamihafana ao amin'ny neurons Mfn2cKO amin'ny 8 herinandro (sanda fanapahana manan-danja 1.3). (G) Ny fanadihadiana ny lalan'ny famoronana dia mampiseho ny lalan'ny fiakarana (mena) sy ny fidinana (manga) manan-danja indrindra ao amin'ny PN Mfn2cKO voasokajy ho 8 herinandro. Aseho ny salan'isan'ny haavon'ny fanehoana ny proteinina tsirairay hita. Sarintany hafanana grayscale: sanda P voahitsy. ns, tsy zava-dehibe.
Nasehon'ny angon-drakitra momba ny proteômika fa nihena tsikelikely ny fanehoana proteinina ao amin'ny complexes I, III, ary IV. Ny complexes I, III, ary IV dia samy nahitana subunits manan-danja voafehin'ny mtDNA, raha ny complexe II kosa, izay voafehin'ny nokleary ihany, dia tsy nisy fiantraikany tamin'ny ankapobeny (Sary 2A sy Sary S2A). Mifanaraka amin'ny valin'ny proteômika, ny immunohistochemistry amin'ny fizarana sela cerebellar dia naneho fa nihena tsikelikely ny haavon'ny subunit MTCO1 (mitochondrial cytochrome C oxidase subunit 1) an'ny complexe IV ao amin'ny PN (Sary 2B). Nihena be ny subunit Mtatp8 voafehin'ny mtDNA (Sary S2A), raha tsy niova kosa ny haavon'ny stable-state an'ny subunit ATP synthase voafehin'ny nokleary, izay mifanaraka amin'ny complexe F1 stable ATP synthase subassembly fantatra rehefa marin-toerana ny fanehoana mtDNA. Mitovy ny fiforonan'ny sela. Interrupt (7). Ny fanombanana ny haavon'ny mtDNA ao amin'ny Mfn2cKO PN voasokajy amin'ny alàlan'ny real-time polymerase chain reaction (qPCR) dia nanamafy ny fihenan'ny isan'ny kopian'ny mtDNA miandalana. Raha ampitahaina amin'ny vondrona fanaraha-maso, tamin'ny 8 herinandro, dia 20% eo ho eo amin'ny haavon'ny mtDNA ihany no voatazona (Sary 2C). Mifanaraka amin'ireo valiny ireo, ny fandokoana mikroskopia confocal an'ny Mfn2cKO PN dia nampiasaina mba hamantarana ny ADN, izay mampiseho ny fanjifana miankina amin'ny fotoana ny nucleotides mitochondrial (Sary 2D). Hitanay fa ny kandidà sasany tafiditra amin'ny fahasimban'ny proteinina mitochondrial sy ny valin'ny stress ihany no niakatra, anisan'izany ny Lonp1, Afg3l2 sy Clpx, ary ny OXPHOS complex assembly factors. Tsy nisy fiovana lehibe teo amin'ny haavon'ny proteinina tafiditra amin'ny apoptosis hita (Sary S2B). Toy izany koa, hitanay fa ny mitochondria sy ny fantsona reticulum endoplasmic tafiditra amin'ny fitaterana kalsioma dia manana fiovana kely fotsiny (Sary S2C). Ankoatra izany, ny fanombanana ny proteinina mifandraika amin'ny autophagy dia tsy nahita fiovana manan-danja, izay mifanaraka amin'ny famporisihana hita maso ny autophagosomes hita in vivo amin'ny alàlan'ny immunohistochemistry sy mikroskopia elektrôna (Sary S3). Na izany aza, ny tsy fahatomombanan'ny OXPHOS miandalana ao amin'ny PN dia miaraka amin'ny fiovana miharihary amin'ny mitochondria ultrastructural. Hita ao amin'ny vatan'ny sela sy ny hazo dendritic an'ny Mfn2cKO PNs 5 sy 8 herinandro ny vondron-mitokondria, ary ny firafitry ny membrane anatiny dia nandalo fiovana lalina (Sary S4, A sy B). Mifanaraka amin'ireo fiovana ultrastructural sy ny fihenan'ny mtDNA manan-danja, ny fanadihadiana ny silaka cerebellar cerebral acute miaraka amin'ny tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) dia naneho fa nihena be ny mety ho vitan'ny membrane mitochondria ao amin'ny Mfn2cKO PNs (Sary S4C).
(A) Famakafakana ny fizotran'ny fotoana amin'ny haavon'ny fanehoana ny complexe OXPHOS. Diniho fotsiny ireo proteinina manana P<0.05 amin'ny 8 herinandro (ANOVA roa). Tsipika teboteboka: Tsy misy fanitsiana raha oharina amin'ny CTRL. (B) Havia: Ohatra iray amin'ny fizarana cerebellar misy marika anti-MTCO1 (bar mizana, 20 μm). Rakotra mavo ny faritra misy ny vatan'ny sela Purkinje. Ankavanana: Fandrefesana ny haavon'ny MTCO1 (famakafakana ny fiovaovana amin'ny lafiny iray; n = sela 7 hatramin'ny 20 nodinihina avy amin'ny totozy telo). (C) Famakafakana qPCR ny isan'ny kopian'ny mtDNA ao amin'ny PN voalamina (famakafakana ny fiovaovana amin'ny lafiny iray; n = totozy 3 hatramin'ny 7). (D) Havia: Ohatra iray amin'ny silaka cerebellar misy marika anti-ADN (bar mizana, 20 μm). Rakotra mavo ny faritra misy ny vatan'ny sela Purkinje. Ankavanana: Fandrefesana ny lesions mtDNA (famakafakana ny fiovaovana amin'ny lafiny iray; n = sela 5 hatramin'ny 9 avy amin'ny totozy telo). (E) Ohatra iray amin'ny fizarana cerebellar acute mampiseho ny sela mitoYFP + Purkinje (zana-tsipìka) ao amin'ny fandraketana patch clamp manerana ny sela. (F) Fandrefesana ny fiolahana IV. (G) Fandraketana solontenan'ny tsindrona courant depolarizing ao amin'ny sela CTRL sy Mfn2cKO Purkinje. Top trace: Ny pulse voalohany izay nampihetsika ny AP. Bottom trace: Fatran'ny AP ambony indrindra. (H) Fandrefesana ny fidirana tampoka postsynaptic (sPSPs). Ny trace fandraketana solontena sy ny tahan'ny zoom dia aseho ao amin'ny (I). Famakafakana tokana momba ny variance nodinihina n = 5 hatramin'ny 20 sela avy amin'ny totozy telo. Ny angon-drakitra dia aseho ho toy ny salan'isa ± SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Trace solontenan'ny AP tampoka voarakitra amin'ny alàlan'ny fomba fametahana patch perforated. Top trace: Fatran'ny AP ambony indrindra. Bottom trace: zoom an'ny AP tokana. (K) Fandrefesana ny salan'isa sy ny fatran'ny AP ambony indrindra araka ny (J). Fitsapana Mann-Whitney; n = 5 sela nodinihina avy amin'ny totozy efatra. Aseho ho salan'isa ± SEM ny angona; tsy zava-dehibe.
Hita fa nisy fahasimbana OXPHOS miharihary tao amin'ny Mfn2cKO PN 8 herinandro, izay midika fa tena tsy ara-dalàna ny fiasan'ny neurons ara-batana. Noho izany, nodinihinay ny toetra elektrika passive an'ny neurons tsy ampy OXPHOS tamin'ny 4 ka hatramin'ny 5 herinandro sy 7 ka hatramin'ny 8 herinandro tamin'ny alàlan'ny fanaovana firaketana patch clamp manerana ny sela amin'ny silaka cerebellar acute (Sary 2E). Tsy nampoizina fa mitovy amin'ny fanaraha-maso ny salan'isa mety ho vitan'ny membrane resting sy ny fanoherana ny fidirana an'ny neurons Mfn2cKO, na dia nisy fahasamihafana kely aza teo amin'ny sela (Tabilao 1). Toy izany koa, tamin'ny 4 ka hatramin'ny 5 herinandro, dia tsy nisy fiovana lehibe teo amin'ny fifandraisan'ny courant-voltage (IV curve) hita (Sary 2F). Na izany aza, tsy nisy neurons Mfn2cKO 7 ka hatramin'ny 8 herinandro tafavoaka velona tamin'ny fitsaboana IV (dingana hyperpolarization), izay midika fa misy fahatsapana mazava amin'ny mety ho vitan'ny hyperpolarization amin'ity dingana farany ity. Mifanohitra amin'izany kosa, ao amin'ny neurons Mfn2cKO, ny fikorianan'ny depolarizing izay miteraka fivoahan'ny hery miasa miverimberina (AP) dia leferina tsara, izay midika fa ny lamina fivoahan'izy ireo amin'ny ankapobeny dia tsy dia misy fahasamihafana firy amin'ny an'ny neurons fanaraha-maso 8 herinandro (Tabilao 1 sy Sary 2G). Toy izany koa, ny matetika sy ny amplitude an'ny fikorianan'ny postsynaptic spontaneous (sPSCs) dia azo ampitahaina amin'ny an'ny vondrona fanaraha-maso, ary ny matetika ny zava-mitranga dia nitombo avy amin'ny 4 herinandro ka hatramin'ny 5 herinandro ka hatramin'ny 7 herinandro ka hatramin'ny 8 herinandro miaraka amin'ny fitomboana mitovy (Sary 2, H sy I). Ny vanim-potoanan'ny fahamatorana synaptic ao amin'ny PNs (25). Vokatra mitovy amin'izany no azo taorian'ny patch PNs perforated. Io configuration io dia misoroka ny mety ho fanonerana ny lesoka ATP sela, toy ny mety hitranga amin'ny firaketana patch clamp manontolo. Indrindra indrindra, ny mety ho an'ny membrane resting sy ny matetika firing spontaneous an'ny neurons Mfn2cKO dia tsy voakasika (Sary 2, J sy K). Raha fintinina, ireo valiny ireo dia manondro fa ny PN manana olana miharihary amin'ny OXPHOS dia afaka miatrika tsara ny lamina famoahana matetika avo lenta, izay manondro fa misy rafitra fanonerana izay ahafahan'izy ireo mitazona valinteny elektrofiziolojika saika ara-dalàna.
Aseho amin'ny salan'isa ± SEM (fanadihadiana tokana momba ny fiovaovana, fitsapana fampitahana marobe an'i Holm-Sidak; *P<0.05) ny angon-drakitra. Aseho amin'ny fononteny ny isa singa.
Nikasa ny hanadihady izahay raha misy sokajy ao amin'ny angon-drakitra momba ny proteomics (Sary 1G) ahitana lalana afaka manohitra ny tsy fahampian'ny OXPHOS mafy, ka manazava ny antony ahafahan'ny PN voakasik'izany mitazona electrophysiology saika ara-dalàna (Sary 2, E hatramin'ny K). Ny fanadihadiana momba ny proteomics dia naneho fa ireo anzima tafiditra amin'ny katabolisma ny asidra amine rojo sampana (BCAA) dia niakatra be (Sary 3A sy Sary S5A), ary ny vokatra farany acetyl-CoA (CoA) na succinyl CoA dia afaka manampy ny tricarboxylates amin'ny tsingerin'ny arteriosclerosis Acid (TCA). Hitanay fa nitombo ny votoatin'ny BCAA transaminase 1 (BCAT1) sy BCAT2. Izy ireo dia mandrisika ny dingana voalohany amin'ny katabolisma BCAA amin'ny alàlan'ny famokarana glutamate avy amin'ny α-ketoglutarate (26). Mitombo ny isan'ny singa rehetra mandrafitra ny "branched chain keto acid dehydrogenase" (BCKD) complex (ny "complex" dia mandrisika ny decarboxylation" tsy azo ovaina intsony amin'ny taolana karbônina BCAA vokarina) (Sary 3A sy Sary S5A). Na izany aza, tsy nisy fiovana miharihary hita tao amin'ny BCAA tao amin'ny PN voasokajy, izay mety ho vokatry ny fitomboan'ny fidiran'ny sela ireo asidra amine tena ilaina ireo na ny fampiasana loharano hafa (glucose na asidra laktika) mba hanampiana ny tsingerin'ny TCA (Sary S5B). Ny PN tsy misy OXPHOS dia naneho fitomboan'ny asa faharavan'ny glutamine sy ny transamination amin'ny 8 herinandro, izay azo hita taratra amin'ny fitomboan'ny anzima mitochondrial glutaminase (GLS) sy glutamine pyruvate transaminase 2 (GPT2) (Sary 3, A sy C). Tsara homarihina fa ny fiakaran'ny GLS dia voafetra amin'ny spliced ​​​​isoform glutaminase C (GLS-GAC) (ny fiovan'ny Mfn2cKO/CTRL dia eo amin'ny 4.5 heny eo ho eo, P = 0.05), ary ny fiakarany manokana ao amin'ny sela homamiadana dia afaka manohana ny bioenergy mitochondrial. (27).
(A) Ny sarintany hafanana dia mampiseho ny fiovan'ny haavon'ny proteinina ho an'ny lalana voafaritra amin'ny herinandro 8. (B) Ohatra amin'ny silaka cerebellar misy marika anti-PCx (bar mizana, 20 μm). Ny zana-tsipìka mavo dia manondro ny vatan'ny sela Purkinje. (C) Famakafakana ny fanehoana proteinina amin'ny fotoana voafaritra ho kandidà manan-danja amin'ny atherosclerosis (fitsapana-t marobe, *FDR <5%; n = totozy 3-5). (D) Ambony: Kisarisary skematika mampiseho ny fomba samihafa hidirana ny karbônina misy marika ao amin'ny tracer [1-13C]pyruvate (izany hoe, amin'ny alàlan'ny PDH na lalana trans-arterial). Ambany: Ny tabilao violin dia mampiseho ny isan-jaton'ny karbônina misy marika tokana (M1) niova ho asidra aspartic, asidra citric ary asidra malic rehefa avy nasiana marika [1-13C]pyruvate (fitsapana-t miaraka; ** P <0.01) ny silaka cerebellar acute. (E) Famakafakana feno momba ny tantaran'ny fotoana amin'ny lalana voalaza. Diniho ihany ny proteinina misy P<0.05 amin'ny herinandro 8. Tsipika tapaka: tsy misy sanda fanitsiana (fanadihadiana roa sosona momba ny fiovaovana; * P <0.05; *** P <0.001). Ny angon-drakitra dia aseho amin'ny salan'isa ± SEM.
Tao amin'ny fanadihadianay, ny katabolisma BCAA dia lasa iray amin'ireo lalan-dàlana lehibe amin'ny fiakaran'ny tosidrà. Io zava-misy io dia manondro mafy fa ny habetsaky ny rivotra miditra amin'ny tsingerin'ny TCA dia mety hiova ao amin'ny PN tsy misy OXPHOS. Mety maneho endrika lehibe amin'ny famerenana ny metabolisma neuronal izany, izay mety hisy fiantraikany mivantana amin'ny fiziolojia neuronal sy ny fahavelomana mandritra ny fitazonana ny tsy fahatomombanan'ny OXPHOS mafy. Mifanaraka amin'io petra-kevitra io, hitanay fa ny anzima anti-atherosclerotic PCx lehibe dia miakatra (Mfn2cKO/CTRL miova in-1.5 eo ho eo; Sary 3A), izay mandrisika ny fiovan'ny pyruvate ho oxaloacetate (28), izay inoana fa ao amin'ny sela ao amin'ny atidoha. Ny fanehoana ao dia voafetra ho an'ny astrocytes (29, 30). Mifanaraka amin'ny valin'ny proteomics, ny mikroskopia confocal dia naneho fa ny fanehoana PCx dia nitombo manokana sy be dia be tao amin'ny PN tsy ampy OXPHOS, raha ny fihetsiky ny PCx kosa dia voafetra indrindra amin'ny sela glial Bergmann mifanila amin'ny fanaraha-maso (Sary 3B). Mba hitsapana ara-paika ny fiakaran'ny PCx hita, dia notsaboinay tamin'ny [1-13C]pyruvate tracer ireo silaka cerebellar acute. Rehefa no-oxidize-n'ny pyruvate dehydrogenase (PDH) ny pyruvate, dia nanjavona ny marika isotope-ny, saingy tafiditra ao anatin'ny TCA cycle intermediates rehefa metabolized amin'ny alalan'ny vascular reactions ny pyruvate (Sary 3D). Ho fanohanana ny angon-drakitra proteomics anay, dia nahita marika maro avy amin'ity tracer ity izahay tao amin'ny asidra aspartic an'ny silaka Mfn2cKO, raha toa kosa ka nanana fironana antonony ny asidra citric sy ny asidra malic, na dia tsy manan-danja aza (Sary 3D).
Ao amin'ny neurons dopamine an'ny totozy MitoPark izay manana tsy fahatomombanan'ny mitochondria vokatry ny neurons dopamine izay manimba manokana ny gène transcription factor A (Tfam) mitochondria (Sary S6B), dia niakatra be ihany koa ny fanehoana PCx (31), izay manondro fa ny fisian'ny aretina dia voafehy mandritra ny tsy fahatomombanan'ny neuronal OXPHOS ao amin'ny vatana. Tsara homarihina fa hita fa ny anzima miavaka (32-34) izay mety hiseho ao amin'ny neurons izay mety mifandray amin'ny arteriosclerosis dia miakatra be ao amin'ny PNs tsy misy OXPHOS, toy ny propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA manova ny propionyl-CoA ho succinyl-CoA ary ny mitochondrial malic enzyme 3 (ME3), izay ny anjara asany lehibe indrindra dia ny famerenana ny pyruvate avy amin'ny malate (Sary 3, A sy C) (33, 35). Ankoatra izany, nahita fitomboana be dia be tao amin'ny anzima Pdk3 izahay, izay mampiroborobo ny phosphorylation ary noho izany dia manafoana ny PDH (36), raha tsy nisy fiovana hita tao amin'ny anzima Pdp1 izay mampihetsika ny PDH na ny complexe anzima PDH mihitsy (Sary 3A). Mifanaraka amin'izany, ao amin'ny Mern2cKO PNs, ny phosphorylation an'ny subunit α1 α (PDHE1α) subunit an'ny pyruvate dehydrogenase E1 component an'ny complexe PDH ao amin'ny Ser293 (fantatra fa manakana ny asan'ny anzima PDH) dia nihamafy (Sary S6C) (Sary S6C). Tsy manana fidirana amin'ny lalan-dra ny Pyruvate.
Farany, hitanay fa ny lalan'ny biosynthesis serine sy glycine, ny tsingerin'ny folate mitochondrial (1C) mifandraika amin'izany ary ny biosynthesis proline (Sary 1G sy Sary S5C) dia samy niakatra be avokoa, araka ny tatitra, nandritra ny dingan'ny fampahavitrihana. Mihetsika miaraka amin'ny tsy fahatomombanan'ny mitochondrial ny sela manodidina (5-7). Ny fanadihadiana confocal manohana ireo angon-drakitra proteomics ireo dia naneho fa tao amin'ny PN tsy misy OXPHOS, ny silaka cerebellar an'ny totozy 8 herinandro dia nampiharana serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2), anzima fototra amin'ny tsingerin'ny folate mitochondrial. Valin-kafatra mahery vaika (Sary S5D). Tao amin'ny silaka cerebellar acute 13 nampidirina CU-glucose, ny andrana fanaraha-maso metabolika dia nanamafy bebe kokoa ny fiakaran'ny biosynthesis serine sy proline, izay manondro fa nitombo ny fikorianan'ny isoforms karbônina ho serine sy proline (Sary S5E). Koa satria ny fihetsika amporisihin'ny GLS sy GPT2 no tompon'andraikitra amin'ny fananganana glutamate avy amin'ny glutamine sy ny transamination eo amin'ny glutamate sy α-ketoglutarate, ny fiakaran'izy ireo dia manondro fa ny neurons tsy ampy OXPHOS dia mila glutamate bebe kokoa. Mety ho mikendry ny hitazona ny fitomboan'ny biosynthesis proline izany (Sary S5C). Mifanohitra amin'ireo fiovana ireo, ny fanadihadiana proteomika momba ny astrocytes cerebellar avy amin'ny totozy Mfn2cKO manokana PN dia naneho fa ireo lalan-dàlana ireo (anisan'izany ny antiperoxidases rehetra) dia tsy niova be tamin'ny fanehoana, ka mampiseho izany fa ity famindrana metabolika ity dia mifantina amin'ny PN simba (Sary S6, D hatramin'ny G).
Raha fintinina, ireo fanadihadiana ireo dia naneho lamina samihafa amin'ny fampandehanana ara-potoana ny lalan'ny metabolika manokana ao amin'ny PN. Na dia mety hiteraka atherosclerosis aloha loatra sy fanavaozana 1C (Sary 3E sy Sary S5C) aza ny fiasan'ny mitochondria neuronal tsy ara-dalàna, ary na dia ny fiovana azo vinavinaina amin'ny fanehoana ny complexe I sy IV aza, ny fiovan'ny serine de novo synthesis dia hita ihany amin'ny dingana farany. Tsy fiasan'ny OXPHOS (Sary 3E sy Sary S5C). Ireo zavatra hita ireo dia mamaritra dingana mifanesy izay iarahan'ny mitochondria (cycle 1C) sy cytoplasmic (biosynthesis serine) vokatry ny adin-tsaina miasa miaraka amin'ny fitomboan'ny atherosclerosis ao amin'ny tsingerin'ny TCA mba hamolavola indray ny metabolisman'ny neuronal.
Ireo PN tsy ampy OXPHOS 8 herinandro dia afaka mitazona hetsika fanentanana avo lenta ary mandalo fifandraisana metabolika manan-danja mba hanonerana ny tsy fahatomombanan'ny mitochondria. Ity fahitana ity dia mampiakatra ny mety ho azo atao fa na dia amin'izao fotoana izao aza, ireo sela ireo dia mety hahazo fitsaboana ihany koa mba hanemorana na hisorohana ny neurodegeneration. Tara. Namaha io mety ho azo atao io tamin'ny alàlan'ny fitsaboana roa mahaleo tena izahay. Tamin'ny fomba voalohany, dia namorona vector viriosy adeno-associated (AAV) miankina amin'ny Cre izahay mba hahafahan'ny MFN2 maneho amin'ny fomba voafantina ao amin'ny PN tsy ampy OXPHOS in vivo (Sary S7A). Ny AAV izay mandika ny MFN2 sy ny gène mpanao tatitra fluorescent mCherry (Mfn2-AAV) dia nohamarinina tao amin'ny kolontsaina neuron voalohany in vitro, izay nahatonga ny MFN2 haneho amin'ny fomba miankina amin'ny Cre ary namonjy ny morphology mitochondria, ka nisoroka ny neuromutation tao amin'ny neurons Mfn2cKO (Sary S7, B, D ary E). Manaraka izany, nanao andrana in vivo izahay mba handefasana Mfn2-AAV 8 herinandro amin'ny alalan'ny stereotactic mankany amin'ny cortex cerebellar an'ny totozy Mfn2cKO sy ny totozy fanaraha-maso, ary nandinika totozy 12 herinandro (Sary 4A). Maty ireo totozy Mfn2cKO notsaboina (Sary 1, A sy B) (16). Ny fifindran'ny viriosy in vivo dia niafara tamin'ny fanehoana voafantina ny PN tamin'ny faribolana cerebellar sasany (Sary S7, G sy H). Ny tsindrona ny AAV fanaraha-maso izay maneho mCherry ihany (Ctrl-AAV) dia tsy nisy fiantraikany lehibe tamin'ny haavon'ny neurodegeneration tamin'ny biby Mfn2cKO. Mifanohitra amin'izany, ny fanadihadiana ny Mfn2cKOs nafindra tamin'ny Mfn2-AAV dia naneho fiantraikany fiarovana lehibe teo amin'ny sosona sela PN (Sary 4, B sy C). Indrindra indrindra, ny hakitroky ny neuron dia toa tsy azo avahana amin'ny biby fanaraha-maso (Sary 4, B sy C, ary Sary S7, H sy I). Ny fanehoana ny MFN1 fa tsy ny MFN2 dia mitovy amin'ny fahombiazany amin'ny fiarovana ny fahafatesan'ny neurona (Sary 4C sy Sary S7, C sy F), izay manondro fa ny fanehoana ny MFN1 ectopic dia afaka mameno tsara ny tsy fahampian'ny MFN2. Ny fanadihadiana fanampiny amin'ny ambaratonga PN tokana dia naneho fa ny Mfn2-AAV dia namonjy betsaka ny ultrastructure an'ny mitochondria, nanatsara ny haavon'ny mtDNA, ary nanova ny fanehoana avo lenta ny marika anti-angiogenesis PCx ​​(Sary 4, C hatramin'ny E). Ny fijerena maso ireo totozy Mfn2cKO voavonjy tao amin'ny toetry ny fitsaharana dia naneho fa nihatsara ny fihetsika sy ny soritr'aretin'ny fihetsehana (fihetsehana S1 hatramin'ny S3). Ho fehin-kevitra, ireo fanandramana ireo dia mampiseho fa ny fampidirana indray ny MFN2 amin'ny PNs izay tsy ampy OXPHOS dia ampy hamerenana ny fihinanana mtDNA sy hiteraka atherosclerosis, ka hisorohana ny fahasimban'ny axon sy ny fahafatesan'ny neurona in vivo.
(A) Tetikasa mampiseho ny fandaharam-potoana fanandramana amin'ny fampidirana AAV izay mandika ny MFN2 rehefa miasa ny lalan'ny metabolika voalaza. (B) Sary confocal maneho ny silaka cerebellar 12 herinandro nafindra tamin'ny 8 herinandro tamin'ny totozy Mfn2cKO ary nasiana marika anti-Calbindin antibody. Ankavanana: Famaritana ny fibre axon. Ny haben'ny zoom axon dia 450 sy 75 μm. (C) Havia: Fandrefesana ny hakitroky ny sela Purkinje ao amin'ny tadivavarana transduction AAV (AAV+) (fanadihadiana tokana momba ny variance; n = totozy 3). Ankavanana: fanadihadiana ny fifantohana mtDNA ao amin'ny PN nafindra tamin'ny herinandro 12 (t-test tsy misy tsiroaroa; n = sela 6 avy amin'ny totozy telo). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Mikrografy elektrôna fandefasana solontenan'ny PN amin'ny fizarana cerebellar Mfn2cKO nafindra tamin'ny vectors viral voalaza. Ny saron-tava mavokely dia maneho ny faritra misy ny dendrita, ary ny efamira misy teboka mavo dia maneho ny zoom omena eo ankavanana; n dia maneho ny vihy. Ny bara mizana, 1μm. (E) dia mampiseho ohatra iray amin'ny fandokoana PCx ao amin'ny PN nafindra tamin'ny herinandro 12. Ny bara mizana, 20μm. OE, fihoaram-pefy; FC, fiovan'ny vala.
Farany, nodinihinay ny maha-zava-dehibe ny fahaveloman'ny sela vokatry ny peroxidase amin'ny PN izay niaina ny tsy fahatomombanan'ny OXPHOS. Namorona mCherry izay mandika ny AAV-shRNA (short hairpin RNA) izahay izay mikendry manokana ny mRNA PCx amin'ny totozy (AAV-shPCx), ary nampiditra ny viriosy na ny fanaraha-maso mifangaro (AAV-scr) tao amin'ny cerebellum an'ny totozy Mfn2cKO. Natao tamin'ny herinandro fahefatra (Sary 5A) ny tsindrona mba hahazoana PCx knockdown mahomby mandritra ny vanim-potoana nitomboan'ny fanehoana PCx (Sary 3C) ary mbola tsy simba ny sosona sela PN (Sary 1A). Tsara homarihina fa ny fandringanana ny PCx (Sary S8A) dia mitarika ho amin'ny fanafainganana be ny fahafatesan'ny PN, izay voafetra ho an'ny peratra voan'ny aretina (Sary 5, B sy C). Mba hahatakarana ny mekanisma ateraky ny fiantraikan'ny metabolisma vokatry ny fiakaran'ny PCx, dia nodinihinay ny toetry ny redox an'ny PNs taorian'ny nanehoana niaraka ny PCx knockdown sy ny AAV-mediated optical biosensor Grx1-roGFP2 (Sary S8, B hatramin'ny D) mba hanombanana ny fiovan'ny glutathione amin'ny mety ho redox peptide (38). Avy eo, dia nanao mikroskopia sary fluorescence roa-photon mandritra ny androm-piainana (FLIM) izahay tao amin'ny silaka atidoha acute an'ny Mfn2cKO 7 herinandro na ireo biby fanaraha-maso mba hamantarana ny fiovana mety hitranga amin'ny toetry ny redox cytoplasmic rehefa avy nanamarina ny fepetra FLIM (Sary S8, E hatramin'ny G). Ny fanadihadiana dia naneho fitomboana lehibe teo amin'ny toetry ny oksidasionan'ny PN Mfn2cKO tokana tsy misy fanehoana PCx, izay tsy mitovy amin'ny neurons fanaraha-maso na PN Mfn2cKO izay maneho shRNA voahodina fotsiny (Sary 5, D sy E). Rehefa nihena ny fanehoana PCx, dia nitombo mihoatra ny intelo ny isan-jaton'ny Mfn2cKO PNs izay naneho toetry ny oksidasiona be (Sary 5E), izay midika fa ny fiakaran'ny PCx dia nitazona ny fahafahan'ny neurons simba redox.
(A) Tetikasa mampiseho ny fandaharam-potoanan'ny fanandramana amin'ny fampidirana AAV izay mandika shPCx rehefa miasa ny lalan'ny metabolika voalaza. (B) Sary confocal maneho ny fizarana cerebellar 8 herinandro ao amin'ny totozy Mfn2cKO nafindra sy nasiana marika tamin'ny antibody anti-calcineurin tamin'ny 4 herinandro. Bara mizana, 450μm. (C) Fandrefesana ny hakitroky ny sela Purkinje ao amin'ny tadivavarana nafindra AAV (fanadihadiana tokana momba ny variance; n = 3 hatramin'ny 4). Ny angon-drakitra dia aseho amin'ny salan'isa ± SEM; ***P<0.001. (D) Sary FLIM maneho ny androm-piainan'ny PN 7 herinandro izay maneho sensor glutathione redox Grx1-roGFP2 eo ambanin'ny fepetra fanandramana voafaritra. Tahan'ny LUT (tabilao fijerena): elanelam-potoana velona (amin'ny picoseconds). Bara mizana, 25μm. (E) Ny histograma dia mampiseho ny fizarana ny sandan'ny androm-piainan'ny Grx1-roGFP2 avy amin'ny (D) (n=158 ka hatramin'ny 368 sela amin'ny totozy roa isaky ny fepetra). Ny tabilao boribory eo ambonin'ny histograma tsirairay: dia mampiseho ny isan'ny sela manana sandan'ny androm-piainana lava kokoa (mena, oksidana) na fohy kokoa (manga, mihena), izay mihoatra ny 1 SD amin'ny sandan'ny androm-piainana antonony ao amin'ny CTRL-AAV-scr. (F) Ny modely naroso dia mampiseho ny fiantraikan'ny fiakaran'ny PCx neuronal ho fiarovana.
Raha fintinina, ny angon-drakitra omenay eto dia mampiseho fa ny famerenana ny fanehoana ny MFN2 dia afaka mamonjy tanteraka ny PN mandroso miaraka amin'ny tsy fahampian'ny OXPHOS mafy, fihenan'ny mtDNA mafy, ary endrika tsy ara-dalàna toy ny ista, ka manome fandrosoana mitohy na dia amin'ny aretina mandroso aza. Ny neurodegeneration dia manome porofo azo averina amin'ny laoniny ny dingana alohan'ny fahafatesan'ny sela. Io ambaratongan'ny fahafaha-miovaova ara-metabolisma io dia hamafisin'ny fahafahan'ny neurons miteraka atherosclerosis (famerenana ny tsingerin'ny TCA), izay manakana ny fanehoana PCx amin'ny PN tsy misy OXPHOS ary mampitombo ny fahafatesan'ny sela, ka mitana anjara toerana fiarovana (Sary 5F).
Ato amin'ity fanadihadiana ity, nanome porofo izahay fa ny fihetsiky ny PN amin'ny tsy fahatomombanan'ny OXPHOS dia ny mihaona tsikelikely amin'ny atherosclerosis amin'ny tsingerin'ny TCA amin'ny alàlan'ny lalan'ny fampahavitrihana samihafa izay ampiasain'ny fandaharan'asa metabolika. Nohamafisinay ny fanadihadiana proteomika tamin'ny fomba maro mifameno ary nasehonay fa rehefa sendra olana amin'ny tsy fahatomombanan'ny mitochondria mafy, dia manana endrika elasticity metabolika tsy fantatra teo aloha ny neurons. Gaga izahay fa ny dingana famerenana amin'ny laoniny manontolo dia tsy voatery manamarika ny toetry ny metabolika farany izay miaraka amin'ny neurodegeneration tsikelikely sy tsy azo averina intsony, fa ny angon-drakitray dia manondro fa mety ho neuron fikojakojana na dia amin'ny dingana alohan'ny fahafatesan'ny sela aza. Ity fikarohana ity dia manondro fa ny neurons dia manana plasticity metabolika betsaka ao amin'ny vatana. Izany zava-misy izany dia manaporofo fa ny fampidirana indray ny MFN2 taty aoriana dia afaka mamadika ny fanehoana ireo marika metabolika fototra ary misoroka ny fahasimban'ny PN. Mifanohitra amin'izany aza, manakana ny atherosclerosis ary manafaingana ny nerves. transsexual.
Ny iray amin'ireo zavatra hita mahavariana indrindra tamin'ny fikarohanay dia ny hoe ny PN tsy manana OXPHOS dia afaka manova ny metabolisman'ny tsingerin'ny TCA amin'ny alàlan'ny fampitomboana ny anzima izay mandrisika manokana ny arteriosclerosis. Ny fandaminana indray ny metabolisma dia toetra mahazatra amin'ny sela homamiadana, ny sasany amin'izy ireo dia miantehitra amin'ny glutamine mba hanampiana ny mpanelanelana amin'ny tsingerin'ny TCA mba hamokarana mitovy amin'izany, izay mampiroborobo ny rojo taovam-pisefoana ary mitazona ny famokarana lipida sy ny precursors biosynthesis nucleotide (39, 40). Ny fanadihadiana vao haingana dia naneho fa ao amin'ny sela periferika izay miaina tsy fahatomombanan'ny OXPHOS, ny fifandraisana indray ny metabolisma glutamine/glutamate dia toetra miavaka ihany koa (5, 41), izay miankina amin'ny lalan'ny fidiran'ny glutamine ao amin'ny tsingerin'ny TCA. Noho ny hamafin'ny ratra OXPHOS (41). ). Na izany aza, tsy ampy ny porofo mazava momba ny fitoviana amin'ny plasticity metabolika neuronal ao amin'ny vatana sy ny mety ho fifandraisany amin'ny toe-javatra misy ny aretina. Tao amin'ny fanadihadiana in vitro vao haingana, ny neurons cortical voalohany dia naseho fa manetsika ny dobo glutamate ho an'ny neurotransmission, ka mampiroborobo ny metabolisma oxidative sy ny atherosclerosis eo ambanin'ny toe-javatra metabolika stress (42). Tsara homarihina fa eo ambany fanakanana ara-panafody ny anzima TCA cycle succinate dehydrogenase, ny pyruvate carboxylation dia inoana fa mitazona ny fananganana oxaloacetate ao amin'ny neurons granule cerebellar novolena (34). Na izany aza, ny fifandraisan'ireo mekanisma ireo amin'ny sela ao amin'ny atidoha (izay heverina fa ny atherosclerosis dia voafetra indrindra amin'ny astrocytes) dia mbola manana dikany ara-batana manan-danja (43). Amin'ity tranga ity, ny angon-drakitray dia mampiseho fa ny PN simban'ny OXPHOS ao amin'ny vatana dia azo ovaina ho amin'ny fahasimban'ny BCAA sy ny pyruvate carboxylation, izay loharano roa lehibe amin'ny famenoana ny intermediate pool TCA. Na dia efa naroso aza ny fandraisana anjaran'ny catabolism BCAA amin'ny metabolisman'ny angovo neuronal, ankoatra ny anjara asan'ny glutamate sy GABA amin'ny neurotransmission (44), dia mbola tsy misy porofo ho an'ireo mekanisma ireo in vivo. Noho izany, mora ny mieritreritra fa ny PN tsy miasa dia afaka manonitra ho azy ny fihinanana intermediate TCA tarihin'ny dingana assimilation amin'ny alàlan'ny fampitomboana ny atherosclerosis. Indrindra indrindra, ny fiakaran'ny PCx dia mety ilaina mba hihazonana ny fitomboan'ny fangatahana asidra aspartic, izay soso-kevitra amin'ny sela mihamaro miaraka amin'ny tsy fahatomombanan'ny mitochondria (45). Na izany aza, ny fanadihadiana metabolomika nataonay dia tsy naneho fiovana lehibe teo amin'ny haavon'ny asidra aspartic stable ao amin'ny Mfn2cKO PNs (Sary S6A), izay azo heverina fa maneho ny fampiasana metabolika samihafa ny asidra aspartic eo amin'ny sela mihamaro sy ny neurons post-mitotic. Na dia mbola tsy voafaritra aza ny mekanisma marina amin'ny fiakaran'ny PCx amin'ny neurons tsy miasa in vivo, dia nasehonay fa io valinteny aloha loatra io dia mitana anjara toerana lehibe amin'ny fitazonana ny toetry ny redox an'ny neurons, izay naseho tamin'ny andrana FLIM tamin'ny silaka cerebellar. Indrindra indrindra, ny fisorohana ny PNs tsy hampitombo ny PCx dia mety hitarika amin'ny toetry ny oxidized kokoa ary hanafaingana ny fahafatesan'ny sela. Ny fampahavitrihana ny fahasimban'ny BCAA sy ny carboxylation an'ny pyruvate dia tsy fomba hamantarana ny sela periferika amin'ny tsy fahatomombanan'ny mitochondria (7). Noho izany, toa endri-javatra laharam-pahamehana amin'ny neurons tsy ampy OXPHOS izy ireo, na dia tsy izy irery aza, izay zava-dehibe amin'ny neurodegeneration. .
Ny aretin'ny cerebellar dia karazana aretina neurodegenerative tsy mitovy izay matetika miseho amin'ny ataxia ary matetika manimba ny PN (46). Ity vondron'ny neuron ity dia mora voan'ny tsy fahatomombanan'ny mitochondria satria ny fahasimbana voafantina amin'ny totozy dia ampy hamerenana ny soritr'aretina maro amin'ny motera izay mampiavaka ny ataxia spinocerebellar olombelona (16, 47, 48). Araka ny tatitra, ny modely totozy transgenic misy gène mutant dia mifandray amin'ny ataxia spinocerebellar olombelona ary manana tsy fahatomombanan'ny mitochondria (49, 50), izay manantitrantitra ny maha-zava-dehibe ny fandalinana ny vokatry ny tsy fahampian'ny OXPHOS ao amin'ny PNPH. Noho izany, dia mety tsara ny manavaka sy mandalina tsara ity vondron'ny neuron miavaka ity. Na izany aza, satria mora tohina amin'ny tsindry ny PN ary mitaky ampahany kely amin'ny vondron'ny sela cerebellar manontolo, ho an'ny fanadihadiana maro mifototra amin'ny omics, ny fisarahana voafantina azy ireo ho sela iray manontolo dia mbola lafiny sarotra. Na dia saika tsy azo atao aza ny tsy hisian'ny fahalotoan'ny karazana sela hafa tanteraka (indrindra fa ny sela olon-dehibe), dia nampiarahinay ny dingana dissociation mahomby tamin'ny FACS mba hahazoana neurons azo ampiasaina ampy ho an'ny fanadihadiana proteomics any aoriana, ary manana fandrakofana proteinina avo lenta (proteinina 3000 eo ho eo) raha oharina amin'ny angon-drakitra efa misy momba ny cerebellum manontolo (51). Amin'ny alàlan'ny fiarovana ny fahaveloman'ny sela manontolo, ny fomba omenay eto dia tsy vitan'ny hoe mamela anay hijery ny fiovan'ny lalan'ny metabolika ao amin'ny mitochondria, fa hijery ihany koa ny fiovan'ny cytoplasmic mitovy aminy, izay mameno ny fampiasana ny marika membrane mitochondrial mba hanatsarana ny karazana sela. Ny fomba vaovao ho an'ny isan'ny mitochondria ao amin'ny sela sarotra (52, 53). Ny fomba hazavainay dia tsy mifandray amin'ny fandalinana ny sela Purkinje ihany, fa azo ampiharina mora foana amin'ny karazana sela rehetra mba handaminana ny fiovan'ny metabolika ao amin'ny atidoha marary, anisan'izany ny modely hafa amin'ny tsy fahatomombanan'ny mitochondria.
Farany, nahita varavarankely fitsaboana mandritra ity dingana fandaminana indray ny metabolisma ity izahay izay afaka mamadika tanteraka ireo famantarana lehibe amin'ny fihenjanana sela ary misoroka ny fahasimban'ny neurona. Noho izany, ny fahatakarana ny fiantraikan'ny fiasan'ny famerenana ny fifandraisana voalaza eto dia mety hanome fahatakarana fototra momba ny fitsaboana azo atao mba hihazonana ny fahafahan'ny neurona miasa mandritra ny tsy fahatomombanan'ny mitochondria. Ilaina ny fikarohana amin'ny ho avy mikendry ny handinika ny fiovan'ny metabolisman'ny angovo amin'ny karazana sela hafa ao amin'ny atidoha mba hampisehoana tanteraka ny fampiharana ity fitsipika ity amin'ny aretina hafa momba ny neurolojia.
Efa voalaza teo aloha ny totozy MitoPark (31). Ny totozy C57BL/6N miaraka amin'ny fototarazo Mfn2 miampita loxP dia efa voalaza teo aloha (18) ary nampiarahina tamin'ny totozy L7-Cre (23). Ny taranaka heterozygous roa sosona vokatr'izany dia nampiarahina tamin'ny totozy homozygous Mfn2loxP/Mfn2loxP mba hamoronana gène Purkinje manokana ho an'ny Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Tao anatin'ny ampahany amin'ny fanambadiana, ny allele SorStop-mito-YFP Gt (ROSA26) (stop-mtYFP) dia nampidirina tamin'ny alàlan'ny fampiraisana fanampiny (20). Ny fomba fiasa rehetra amin'ny biby dia natao mifanaraka amin'ny torolàlana Eoropeana, nasionaly ary andrim-panjakana ary neken'ny LandesamtfürNatur any Umwelt sy Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Alemaina. Ny asa biby dia manaraka ny torolàlana avy amin'ny Federasiona Eoropeana momba ny Fikambanan'ny Siansa Biby Laboratory ihany koa.
Rehefa avy nodidiana ny vozon-tranonjaza vehivavy bevohoka dia navahana ny embryon-n'ny totozy (E13). Nozaraina tao anaty Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) nasiana Hepes 10 mM ny cortex ary nalefa tamin'ny Dulbecco's Modified Eagle's Medium misy papain (20 U/ml) sy cysteine ​​​​(1μg/ml). Ampidirina ao anaty DMEM ny sela ary sarahina amin'ny alàlan'ny fandevonan-kanina anzima. Ml) amin'ny 37°C mandritra ny 20 minitra, ary avy eo dia totoina amin'ny DMEM nasiana serum bovine foetal 10%. Nafafy teo amin'ny fonony fitaratra voarakotra polylysine amin'ny hakitroky 2×106 isaky ny lovia fambolena 6 sm na amin'ny hakitroky 0.5×105 sela/cm2 ny sela mba hanaovana fanadihadiana sary. Rehefa afaka 4 ora, dia nosoloina medium tsy misy serum Neurobasal misy fanampin-tsakafo B27 1% sy GlutaMax 0.5 mM ny medium. Avy eo dia notazonina tamin'ny 37°C sy 5% CO2 ireo neuron nandritra ny fanandramana, ary nomena indray mandeha isan-kerinandro. Mba hampirisihana ny fampifangaroana in vitro, dia nampiasaina hitsaboana ireo neuron tamin'ny andro faharoa in vitro ny 3μl (lovia kolontsaina misy lavaka 24) na 0.5μl (lovia misy lavaka 24) an'ity vecteur viriosy AAV9 manaraka ity: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, laharana katalaogy 105530-AAV9) sy AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, laharana katalaogy 105545-AAV9).
Ny ADN mifameno amin'ny totozy Mfn1 sy Mfn2 (nalaina avy amin'ny plasmid Addgene #23212 sy #23213) dia asiana marika amin'ny filaharan'ny V5 (GKPIPNPLLGLDST) eo amin'ny C-terminus, ary ampiarahina amin'ny mCherry ao amin'ny frame amin'ny alàlan'ny filaharan'ny T2A. Ny Grx1-roGFP2 dia fanomezana avy amin'ny Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Amin'ny alàlan'ny fanoloana ny kasety tdTomato amin'ny alàlan'ny fomba fandikana mahazatra, dia natsofoka tao amin'ny backbone pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (laharana fanondroana Addgene 28306) ny kasety mba hamoronana vectors pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 ary pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Tetika mitovy amin'izany no nampiasaina mba hamoronana ny vecteur fanaraha-maso pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Mba hamoronana ny AAV-shPCx, dia ilaina ny vecteur plasmid AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), izay misy ny filaharan'ny ADN izay mandika ny shRNA mikendry ny totozy PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Eo ambany fifehezan'ny promoter U6, ny mCherry dia ampiasaina eo ambany fifehezan'ny promoter CMV. Ny famokarana vecteur AAV fanampiny dia natao araka ny torolalan'ny mpanamboatra (Cell Biolabs). Raha fintinina, ampiasao plasmid famindrana mitondra ny mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) amin'ny alalan'ny famindrana vonjimaika ny gène mpamoaka kaody 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) na Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), ary koa ny famadihana ny proteinina kapsida AAV1 sy ny proteinina fanampiny. Ny plasmid fonosana dia nofonosina tamin'ny fomba calcium phosphate. Ny supernatant viriosy manta dia azo tamin'ny alalan'ny tsingerin'ny fampangatsiahana sy ny fanalefahana ao anaty fandroana ranomandry/ethanol maina ary ireo sela nopotehina tao anaty saline phosphate buffered (PBS). Nodiovina tamin'ny alalan'ny ultracentrifugation iodixanol gradient tsy mitohy (24 ora amin'ny 32,000 rpm sy 4°C) ny vecteur AAV ary nohamafisina tamin'ny fampiasana sivana centrifugal Amicon ultra-15. Ny titer genome an'ny AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 kopian'ny genome (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX dia araka ny voalaza teo aloha (54), norefesina tamin'ny alalan'ny PCR quantitative amin'ny fotoana tena izy (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) ary AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
Nesorina tao anaty PBS mangatsiaka be ny neurons voalohany, nopotehina, ary avy eo dia nohafohezina tao anaty Triton X-100 0.5% / sodium deoxycholate/PBS lysis buffer misy phosphatase sy protease inhibitor (Roche). Natao tamin'ny fampiasana ny bicinchoninic acid assay (Thermo Fisher Scientific) ny fandrefesana ny proteinina. Avy eo dia nosarahina tamin'ny alalan'ny electrophoresis gel SDS-polyacrylamide ireo proteinina, ary avy eo dia nopotehina tamin'ny fonon'ny polyvinylidene fluoride (GE Healthcare). Sakanana ireo toerana tsy manokana ary ambolena miaraka amin'ny antibody voalohany (jereo ny Tabilao S1 raha mila fanazavana fanampiny) ao anaty ronono 5% ao amin'ny TBST (Tris-buffered saline miaraka amin'ny Tween), dingana fanasana ary antibody faharoa ao amin'ny TBST Incubate. Ambolena miaraka amin'ny antibody voalohany mandritra ny alina amin'ny +4°C. Rehefa avy nosasana, dia asio antibody faharoa mandritra ny 2 ora amin'ny mari-pana ao an-trano. Aorian'izay, amin'ny alàlan'ny fampidirana ny blot mitovy amin'ny antibody anti-β-actin, dia voamarina ny entana mitovy. Fitiliana amin'ny alàlan'ny fanovana ho chemiluminescence sy fanamafisana ny chemiluminescence (GE Healthcare).
Ireo neurons izay efa nafafy teo amin'ny fonosan'ny fitaratra dia nofafazana tamin'ny 4% paraformaldehyde (PFA)/PBS tamin'ny fotoana voafaritra tamin'ny mari-pana ao an-trano nandritra ny 10 minitra. Ireo fonosan'ny fitaratra dia natsoboka voalohany tamin'ny 0.1% Triton X-100/PBS nandritra ny 5 minitra tamin'ny mari-pana ao an-trano, ary avy eo tao anaty buffer blocking [3% bovine serum albumin (BSA)/PBS]. Tamin'ny andro faharoa, ireo fonosan'ny fitaratra dia nosasana tamin'ny buffer blocking ary notehirizina tamin'ny antibody faharoa fluorophore-conjugated sahaza mandritra ny 2 ora amin'ny mari-pana ao an-trano; farany, ireo santionany dia nosasana tsara tao amin'ny PBS miaraka amin'ny 4′,6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) ary nolokoina tamin'ny loko mifanohitra ary avy eo dia nofafazana tamin'ny slide mikroskopika miaraka amin'ny Aqua-Poly/Mount.
Notsindronina ketamine (130 mg/kg) sy xylazine (10 mg/kg) tao anaty tsindrona ny totozy (lahy sy vavy) ary nomena fanafody fanalefahana fanaintainana carprofen (5 mg/kg) teo ambanin'ny tsinainy. Napetraka tao anaty fitaovana stereotaktika (Kopf) misy lamba mafana. Asehoy ny karandoha ary ampiasao ny fandavahana nify mba hanalefahana ny ampahan'ny cortex cerebellar mifanaraka amin'ny taolana mis (avy amin'ny lambda: rambony 1.8, lateral 1, mifanaraka amin'ny lobules IV sy V). Ampiasao fanjaitra syringe miolikolika mba hamoronana lavaka kely eo amin'ny karandoha mba tsy hanelingelina ny lalan-dra eo ambany. Avy eo dia ampidirina moramora ao amin'ny lavaka kely (manomboka amin'ny -1.3 ka hatramin'ny -1 eo amin'ny ilany ventral amin'ny dura mater) ny kapilary fitaratra manify, ary atsindrona ao amin'ny micro-injector (Narishige) amin'ny alalan'ny syringe tanana (Narishige) imbetsaka amin'ny tsindry ambany mandritra ny 10 ka hatramin'ny 20 minitra ny AAV 200 ka hatramin'ny 300 nl amin'ny tsindry ambany mandritra ny fe-potoana 10 ka hatramin'ny 20 minitra. Aorian'ny fampidirana rano dia apetraho mandritra ny 10 minitra fanampiny ny kapila mba hiparitaka tanteraka ny viriosy. Rehefa nesorina ny kapila dia nozairina tsara ny hoditra mba hampihenana ny fivontosan'ny ratra ary hamela ny biby ho sitrana. Notsaboina tamin'ny fanafody fanalefahana fanaintainana (caspofen) nandritra ny andro maromaro taorian'ny fandidiana ireo biby, nandritra izany fotoana izany dia nojerena tsara ny toe-pahasalamany ary avy eo dia novonoina tamin'ny fotoana voalaza. Ny fomba fiasa rehetra dia natao mifanaraka amin'ny torolàlana Eoropeana, nasionaly ary andrim-panjakana ary neken'ny LandesamtfürNatur avy any Umwelt sy Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Alemaina.
Nomena fanatoranana tamin'ny ketamine (100 mg/kg) sy xylazine (10 mg/kg) ireo biby, ary natsofoka tamin'ny PBS 0.1 M aloha ny fo, ary avy eo tamin'ny PFA 4% tao amin'ny PBS. Nozaraina ny sela ary nofatorana tao amin'ny PBS 4% nandritra ny alina tamin'ny 4°C. Nampiasaina ny antsy mihozongozona (Leica Microsystems GmbH, Vienne, Aotrisy) mba hanomanana ireo fizarana sagittal (50 μm ny hateviny) avy amin'ny atidoha raikitra ao amin'ny PBS. Raha tsy misy voalaza manokana, dia natao araka ny voalaza etsy ambony (13) amin'ny mari-pana ao an-trano sy ny fifangaroana ny fandokoana ireo fizarana mitsingevana malalaka. Raha fintinina, voalohany, ireo silaka azo dia nofonosina tamin'ny Triton X-100/PBS 0.5% nandritra ny 15 minitra tamin'ny mari-pana ao an-trano; ho an'ny epitopes sasany (Pcx sy Shmt2), amin'ny alalan'ny tris-EDTA buffer amin'ny 80°C (PH 9) dia hafanaina mandritra ny 25 minitra ireo silaka fa tsy amin'ity dingana ity. Avy eo, ireo fizarana dia notehirizina tamin'ny antibody voalohany (jereo ny Tabilao S1) tao anaty buffer manakana (3% BSA/PBS) tamin'ny 4°C nandritra ny alina sady nafangaro. Ny ampitson'iny, ireo fizarana dia nosasana tamin'ny buffer manakana ary notehirizina tamin'ny antibody faharoa fluorophore-conjugated sahaza azy mandritra ny 2 ora amin'ny mari-pana ao an-trano; farany, ireo fizarana dia nosasana tsara tao amin'ny PBS, nolokoina tamin'ny DAPI, ary avy eo dia nohamainina tamin'ny AquaPolymount tamin'ny slide mikroskopika.
Mikroskopika confocal amin'ny alalan'ny laser scanning (TCS SP8-X na TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) misy laser hazavana fotsy sy laser ultraviolet diode 405 no nampiasaina mba haka sary ny santionany. Amin'ny alalan'ny fanentanana ny fluorophore sy ny fanangonana ny famantarana amin'ny Hybrid Detector (HyDs), dia nampiasaina ny rindrambaiko LAS-X mba hanangonana sary mifanandrify amin'ny santionany Nyquist amin'ny fomba misesy: ho an'ny takelaka tsy quantitative, dia famantarana tena dinamika (ohatra, ao amin'ny sela somatic sy dendrites) mtYFP) Ampiasao ny HyD mba hamantarana ny isan'ny PN amin'ny fomba BrightR). Ampiharina ny gating manomboka amin'ny 0.3 ka hatramin'ny 6 ns mba hampihenana ny ambadika.
Sary mivantana avy amin'ny sela voasokajy. Rehefa avy nosokajiana tao anaty fitaovana Neurobasal-A misy fanampin-tsakafo B27 1% sy GlutaMax 0.5 mM, dia nafafy avy hatrany tao anaty fitaratra misy poly-l-lysine (μ-Slide8 Well, Ibidi, laharana katalaogy 80826) ny sela, ary avy eo dia tazomy amin'ny 37°C sy 5% CO2 mandritra ny adiny 1 mba hahafahan'ny sela mipetraka. Natao tamin'ny mikroskopia confocal Leica SP8 misy laser fotsy, HyD, family objective menaka 63×[1.4 numerical aperture (NA)] ary sehatra fanafanana ny sary mivantana avy amin'ny sela.
Nofoanana haingana tamin'ny gazy karbonika ny totozy ary notapahina ny lohany, nesorina haingana tamin'ny karandoha ny atidoha, ary notapatapahina ho fizarana sagittal 200μm ny hateviny (ho an'ny andrana fametahana marika 13C) na 275μm ny hateviny (ho an'ny andrana photon roa) izay nofenoina ireto fitaovana manaraka ireto. Ny gilasy (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemaina) dia nofenoina ireto akora manaraka ireto: 125 mM ranoka mangatsiaka be, misy gazy karbonika (95% O2 sy 5% CO2) Ca2 ambany + ranoka cerebrospinal artifisialy (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, buffer phosphate sodium 1.25 mM, 25 mM NaHCO3, gliokaozy 25 mM, 0.5 mM CaCl2 ary 3.5 mM MgCl2 (tsindry osmotika 310 hatramin'ny 330 mmol). Afindrao any amin'ny efitrano mialoha ny fampidirana ireo silaka ati-doha azo izay misy Ca2 + ACSF ambony kokoa (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 ary 2.0 mM MgCl2) antonony) pH 7.4 sy 310 hatramin'ny 320 mmol).
Nandritra ny fizotran'ny fakana sary, dia nafindra tao amin'ny efitrano fakana sary natokana ho an'ny fakana sary ireo silaka, ary natao teo ambanin'ny fikorianan'ny ra ao amin'ny ACSF mitohy amin'ny mari-pana tsy miova eo anelanelan'ny 32° sy 33°C ny andrana. Mikroskopika fitiliana laser multiphoton (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) misy family objective Leica 25x (NA 0.95, rano), laser Ti: Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) no nampiasaina tamin'ny fakana sary silaka. Môdioly FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM an'ny Grx1-roGFP2. Ny fiovan'ny toetry ny redox cytoplasmic an'ny PN dia norefesina tamin'ny alalan'ny FLIM roa-photon tao amin'ny silaka sagittal an'ny atidoha, izay nikendrena ny PN ny biosensor Grx1-roGFP2. Ao amin'ny sosona PN, ny saha fahazoana dia voafantina eo amin'ny 50 ka hatramin'ny 80 μm eo ambanin'ny velaran'ny silaka mba hahazoana antoka fa misy PN azo ampiasaina (izany hoe, ny tsy fisian'ny rafitra beaded na ny fiovan'ny morphological neuronal manaraka ny dendrites) sy ny sensor roGFP2 roa tsara sy ny AAV izay mandika ny shRNA PCx na ny filaharan'ny fanaraha-maso azy (samy maneho mCherry). Angony ny sary tokana misy zoom nomerika 2x [wavelength excitation: 890 nm; 512 nm 512 pixels]. Fitiliana: HyD anatiny, vondrona sivana fluorescein isothiocyanate (FITC)] ary ny salan'isa sary ao anatin'ny 2 ka hatramin'ny 3 minitra dia ampiasaina mba hahazoana antoka fa ampy ny photons voaangona (1000 photons amin'ny fitambarany) ho an'ny fiolahana. Ny fahatsapana ny probe Grx1-roGFP2 sy ny fanamarinana ny fepetra FLIM dia natao tamin'ny fanaraha-maso ny sandan'ny androm-piainan'ny roGFP2 rehefa nanampy H2O2 10 mM avy any ivelany tao amin'ny ACSF perfusion (mba hampitomboana ny oksidasiona, ka hiteraka faharetana maharitra kokoa), ary avy eo nanampy dithiothreitol 2 mM (mampihena ny haavon'ny fihenana, ka miteraka fihenan'ny androm-piainan'ny sela) (Sary S8, D hatramin'ny G). Ampiasao ny rindrambaiko FLIMfit 5.1.1 handinihana ny valiny azo, ampifanaraho amin'ny IRF voarefy (instrument response function) ny fiolahana decay exponential tokana amin'ny sary manontolo, ary eo amin'ny 1 eo ho eo ny χ2. Mba hikajiana ny androm-piainan'ny PN tokana, dia nosarihana tanana ny saron-tava manodidina ny vatan'ny nerveo, ary ny salan'isa androm-piainan'ny saron-tava tsirairay dia nampiasaina ho an'ny fandrefesana.
Famakafakana ny mety ho vitan'ny mitochondria. Rehefa avy notehirizina tamin'ny TMRM 100 nM izay nampiana mivantana tao amin'ny ACSF voadio nandritra ny 30 minitra ny fizarana acute, dia norefesina tamin'ny alalan'ny mikroskopia roa-photon ny fiovan'ny mety ho vitan'ny mitochondria amin'ny PN. Natao tamin'ny alalan'ny fanentanana ny probe tamin'ny 920 nm ny sary TMRM ary nampiasa HyD anatiny (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) mba hanangonana famantarana; tamin'ny alalan'ny fampiasana ny halavan'ny onjam-peo mitovy amin'izany saingy nampiasa HyD anatiny hafa (FITC: 525/50) mba haka sary ny mtYFP. Ampiasao ny plug-in Image Calculator an'ny ImageJ mba hanombanana ny mety ho vitan'ny mitochondria amin'ny ambaratonga sela tokana. Raha fintinina, ny equation plug-in: signal = min (mtYFP, TMRM) dia ampiasaina hamantarana ny faritra mitochondria izay mampiseho ny famantarana TMRM ao amin'ny Purkinje Somali amin'ny sary confocal tokana amin'ny fantsona mifanaraka amin'izany. Avy eo dia kajiana ny velaran'ny pixel ao amin'ny saron-tava vokarina, ary avy eo dia ara-dalàna amin'ny sary tokana mifanaraka amin'izany amin'ny fantsona mtYFP mba hahazoana ny ampahany mitochondrial izay mampiseho ny mety ho vitan'ny mitochondrial.
Novahana tamin'ny alalan'ny rindrambaiko Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) ny sary. Ho an'ny sary taila nozahana, ny fametrahana taila tokana dia atao amin'ny alalan'ny algorithm fanjairana mandeha ho azy avy amin'ny rindrambaiko LAS-X. Aorian'ny fanitsiana ny sary, ampiasao ny ImageJ sy Adobe Photoshop mba hikirakirana bebe kokoa ny sary ary hanitsiana mitovy ny famirapiratana sy ny fifanoherana. Ampiasao ny Adobe Illustrator ho an'ny fanomanana sary.
Famakafakana ny fifantohana mtDNA. Ny isan'ny lesoka mtDNA dia nojerena tamin'ny fizarana cerebellar nasiana marika antikôra manohitra ny ADN tamin'ny alàlan'ny mikroskopia confocal. Ny faritra kendrena tsirairay dia noforonina ho an'ny vatan'ny sela sy ny atin'ny sela tsirairay, ary ny faritra tsirairay dia nokajiana tamin'ny alàlan'ny fampiasana ny plug-in Multi Measure (rindrambaiko ImageJ). Esory amin'ny velaran'ny vatan'ny sela ny velaran'ny nokleary mba hahazoana ny velaran'ny cytoplasmika. Farany, ny plug-in Analyze Particles (rindrambaiko ImageJ) dia nampiasaina mba handrefesana ho azy ny teboka ADN cytoplasmika manondro ny mtDNA eo amin'ny sary tokonam-baravarana, ary ny valiny azo dia naverina tamin'ny salan'isa PN an'ny totozy CTRL. Ny valiny dia aseho ho toy ny salan'isa isan'ny nucleosides isaky ny sela.
Famakafakana ny fanehoana proteinina. Ampiasao ny plug-in Image Calculator an'ny ImageJ mba hanombanana ny fanehoana proteinina ao amin'ny PN amin'ny ambaratonga sela tokana. Raha fintinina, ao amin'ny sary confocal tokana sosona amin'ny fantsona mifandraika amin'izany, amin'ny alàlan'ny fampitoviana: signal = min (mtYFP, antibody), dia fantarina ny faritra mitochondrial izay mampiseho ny fiasan'ny hery fiarovana amin'ny antibody sasany ao amin'ny Purkina. Avy eo dia kajiana ny velaran'ny pixel ao amin'ny saron-tava vokarina, ary avy eo dia ara-dalàna amin'ny sary tokana tokonam-baravaran'ny fantsona mtYFP mifanaraka amin'izany mba hahazoana ny ampahany mitochondrial amin'ny proteinina aseho.
Famakafakana ny hakitroky ny sela Purkinje. Nampiasaina hanombanana ny hakitroky ny Purkinje ny Cell Counter plug-in an'ny ImageJ tamin'ny fizarana ny isan'ny sela Purkinje voaisa amin'ny halavan'ny peratra cerebellar misy ireo sela voaisa.
Fanomanana sy fanangonana santionany. Ny ati-doha avy amin'ny vondrona fanaraha-maso sy ny totozy Mfn2cKO dia nafatotra tamin'ny glutaraldehyde 2% PFA/2.5% tao anaty phosphate buffer (PB) 0.1 M, ary avy eo dia nomanina ny fizarana coronal tamin'ny fampiasana ciliates (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Aotrisy) (Hatevina 50 hatramin'ny 60 μm). Avy eo dia nafatotra tamin'ny PB buffer tao anaty 1% os tetraoxide sy 1.5% potassium ferrocyanide tamin'ny mari-pana ao an-trano nandritra ny 1 ora. Nosasana intelo tamin'ny rano voadio ireo fizarana, ary avy eo dia nolokoina tamin'ny 70% ethanol misy 1% uranyl acetate nandritra ny 20 minitra. Avy eo dia nohamainina tao anaty alikaola naoty ireo fizarana ary natsofoka tao anaty resin epoxy Durcupan ACM (Araldite casting resin M) (Electron Microscopy Sciences, laharana katalaogy 14040) teo anelanelan'ny slide fitaratra voarakotra silicon, ary farany dia napetahana tao anaty lafaoro nandritra ny 48 ora tamin'ny 60°C. Nofantenana ny faritra cortex cerebellar ary notapatapahina tamin'ny Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienne, Aotrisy) ireo fizarana manify dia manify 50 nm ary notapatapahina tamin'ny harato varahina 2 × 1 mm norakofana sarimihetsika polystyrene. Nolokoina tamin'ny vahaolana uranyl acetate 4% tao anaty H2O nandritra ny 10 minitra ireo fizarana, nosasana tamin'ny H2O imbetsaka, avy eo tamin'ny Reynolds lead citrate tao anaty H2O nandritra ny 10 minitra, ary avy eo nosasana tamin'ny H2O imbetsaka. Nalaina tamin'ny mikroskopia elektrôna fandefasana Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Etazonia) ny mikrôgrafia tamin'ny fampiasana fakantsary nomerika TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, Etazonia). Alemaina).
Ho an'ny totozy voan'ny AAV, dia nosarahina ny atidoha ary notapatapahina ho fizarana sagittal 1 mm ny hateviny, ary nojerena tamin'ny alalan'ny mikroskopia fluorescence ny cerebellum mba hamantarana ny peratra voan'ny AAV (izany hoe, mCherry expressing). Ny fanandramana izay ahitana ny tsindrona AAV miteraka fahombiazana avo lenta amin'ny transduction ny sosona sela Purkinje (izany hoe saika ny sosona manontolo) ao anatin'ny peratra cerebellar roa farafahakeliny misesy no ampiasaina. Ny tadivavarana AAV-transduced dia nodidiana kely mba hotehirizina mandritra ny alina aorian'ny fametrahana azy (4% PFA sy 2.5% glutaraldehyde ao anaty buffer cocoate 0.1 M) ary nokarakaraina bebe kokoa. Ho an'ny fametrahana EPON, ny sela raikitra dia nosasana tamin'ny buffer cocoate sodium 0.1 M (Applichem), ary notehirizina tamin'ny OsO4 2% (os, Science Services; Caco) ao anaty buffer cocoate sodium 0.1 M (Applichem) mandritra ny 4 ora, avy eo dia nosasana nandritra ny 2 ora. Avereno in-3 miaraka amin'ny buffer cocamide 0.1 M. Taorian'izay, ny andian-ethanol miakatra dia nampiasaina mba handevenana ny vahaolana etanôla tsirairay amin'ny 4°C mandritra ny 15 minitra mba hanamainana ny sela. Nafindra tao anaty propylene oxide ny sela ary notehirizina nandritra ny alina tao amin'ny EPON (Sigma-Aldrich) tamin'ny 4°C. Apetraho ao anaty EPON vaovao amin'ny mari-pana ao an-trano mandritra ny 2 ora ny sela, ary avy eo dia atsobohy amin'ny 62°C mandritra ny 72 ora. Ampiasao ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) sy antsy diamondra (Diatome, Biel, Soisa) mba hanapahana ireo fizarana manify dia manify 70 nm, ary hosory amin'ny uranyl acetate 1.5% mandritra ny 15 minitra amin'ny 37°C, ary hosory amin'ny vahaolana firaka citrate mandritra ny 4 minitra. Nalaina tamin'ny alalan'ny mikroskopia elektronika fandefasana JEM-2100 Plus (JEOL) misy Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) sy rindrambaiko DigitalMicrograph (Gatan) ny mikrôgrafia elektrôna. Ho an'ny fanadihadiana, dia nalaina tamin'ny alalan'ny zoom nomerika 5000× na 10,000× ny mikrôgrafia elektrôna.
Fanadihadiana morfolojikan'ny mitochondria. Ho an'ny fanadihadiana rehetra, ny endriky ny mitochondria tsirairay dia nohazavaina tanana tamin'ny sary nomerika tamin'ny fampiasana ny rindrambaiko ImageJ. Nohadihadiana ireo masontsivana morfolojika samihafa. Ny hakitroky ny mitochondria dia aseho ho isan-jato azo avy amin'ny fizarana ny velaran'ny mitochondria manontolo amin'ny sela tsirairay amin'ny velaran'ny cytoplasm (velaran'ny cytoplasm = velaran'ny sela-velaran'ny atin'ny sela) × 100. Ny faribolan'ny mitochondria dia kajy amin'ny alalan'ny raikipohy [4π∙(velaran-tany/perimeter 2)]. Nohadihadiana ny morfolojian'ny mitochondria ary nozaraina ho sokajy roa ("tubular" sy "blister") araka ny endriny lehibe.
Famakafakana ny isan'ny autophagosome/lysosome sy ny hakitroky. Ampiasao ny rindrambaiko ImageJ mba hanoritana amin'ny tanana ny endriky ny autophagosome/lysosome tsirairay ao amin'ny sary nomerika. Ny velaran'ny autophagosome/lysosome dia aseho amin'ny isan-jato kajy amin'ny fizarana ny velaran'ny firafitry ny autophagosome/lysosome manontolo amin'ny sela tsirairay amin'ny velaran'ny cytoplasm (velaran'ny cytoplasm=velaran'ny sela-velaran'ny nokleary)×100. Ny hakitroky ny autophagosome/lysosome dia kajy amin'ny fizarana ny isa manontolo amin'ny isan'ny firafitry ny autophagosome/lysosome isaky ny sela (raha jerena ny velaran'ny cytoplasmika) (velaran'ny cytoplasmika = velaran'ny sela-velaran'ny nokleary).
Fametahana marika ho an'ny fizarana tampoka sy fanomanana santionany. Ho an'ny fanandramana izay mitaky fametahana marika gliokaozy, afindrao ao amin'ny efitrano mialoha ny fampidirana ireo silaka atidoha tampoka, izay misy karbônina mahavoky (95% O2 sy 5% CO2), Ca2 + ACSF be dia be (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 ary 2.0 mM MgCl2, namboarina ho pH 7.4 sy 310 hatramin'ny 320 mOsm), izay misy gliokaozy 13C6- Fanoloana gliokaozy (Eurisotop, laharana katalaogy CLM-1396). Ho an'ny andrana izay mitaky fametahana pyruvate, afindrao any amin'ny Ca2 + ACSF ambony kokoa (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 ary ampio 2.0mM MgCl2, amboary amin'ny pH 7.4 ary 310 hatramin'ny 320mOsm), ary ampio 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, laharana katalaogy CLM-1082). Avela hilona mandritra ny 90 minitra amin'ny 37°C ireo andrana. Tamin'ny faran'ny andrana, dia nosasana haingana tamin'ny ranoka misy rano (pH 7.4) misy ammonium carbonate 75 mM ireo andrana, ary avy eo dia nafangaro tamin'ny 40:40:20 (v:v:v) acetonitrile (ACN): methanol: rano. Rehefa avy notehirizina tao anaty ranomandry nandritra ny 30 minitra ireo fizarana, dia notsindrina tamin'ny 21.000 g nandritra ny 10 minitra tamin'ny 4°C ireo santionany, ary nohamainina tao anaty SpeedVac concentrator ny ranoka madio. Ny pellet metabolite maina vokarina dia notehirizina tamin'ny -80°C mandra-pahatongan'ny fanadihadiana.
Famakafakana chromatography ranoka-spectrometry faobe amin'ny asidra amine 13 misy marika C. Ho an'ny famakafakana chromatography ranoka-spectrometry faobe (LC-MS), ny pellet metabolite dia naverina natsipy tao anaty rano LC-MS 75μl (Honeywell). Rehefa avy notifirina tamin'ny 21.000 g nandritra ny 5 minitra tamin'ny 4°C, dia nampiasaina ho an'ny famakafakana ny fivezivezen'ny asidra amine ny 20 μl tamin'ny supernatant nohazavaina, raha ny ambin'ny nalaina kosa dia nampiasaina avy hatrany ho an'ny famakafakana anion (jereo eto ambany). Ny famakafakana asidra amine dia natao tamin'ny fampiasana ny protocole derivatization benzoyl chloride voalaza teo aloha (55, 56). Tamin'ny dingana voalohany, dia nampiana 10μl amin'ny sodium carbonate 100 mM (Sigma-Aldrich) tamin'ny 20μl amin'ny nalaina metabolite, ary avy eo dia nampiana 10μl amin'ny benzoyl chloride 2% (Sigma-Aldrich) tamin'ny ACN LC grade. Nokororohina vetivety ny santionany ary avy eo notsindrina tamin'ny 21.000 g nandritra ny 5 minitra tamin'ny 20°C. Afindra ao anaty tavoahangy autosampler 2 ml misy fitaratra kônika (200 μl volume) ny ranoka efa voadio. Nohadihadiana tamin'ny alalan'ny rafitra Acquity iClass ultra-high performance LC (Waters) mifandray amin'ny Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) high-resolution precision mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) ireo santionany. Ho an'ny fanadihadiana, 2μl amin'ny santionany nodiovina no nampidirina tao anaty tsanganana T3 silica matanjaka 100×1.0 mm (Waters) misy poti-javatra 1.8μm. Ny tahan'ny fikorianan'ny rano dia 100μl/min, ary ny rafitra buffer dia misy buffer A (10 mM ammonium formate sy 0.15% asidra formika ao anaty rano) sy buffer B (ACN). Toy izao ny gradient: 0%B amin'ny 0 minitra; 0%B. 0 hatramin'ny 15% B amin'ny 0 hatramin'ny 0.1 minitra; 15 hatramin'ny 17% B amin'ny 0.1 hatramin'ny 0.5 minitra; B amin'ny 17 hatramin'ny 55% amin'ny 0.5 hatramin'ny 14 minitra; B amin'ny 55 hatramin'ny 70% amin'ny 14 hatramin'ny 14.5 minitra; amin'ny 14.5 hatramin'ny 70 hatramin'ny 100% B amin'ny 18 minitra; 100% B amin'ny 18 hatramin'ny 19 minitra; 100 hatramin'ny 0% B amin'ny 19 hatramin'ny 19.1 minitra; 0% B amin'ny 19.1 hatramin'ny 28 minitra (55, 56). Miasa amin'ny fomba ionisation tsara ny spektrometatra faobe QE-HF miaraka amin'ny elanelan'ny faobe m/z (tahan'ny faobe/fiampangana) 50 hatramin'ny 750. Ny famaha ampiharina dia 60.000, ary ny lasibatra ion gain control (AGC) azo dia 3×106, ary ny fotoana ion ambony indrindra dia 100 milisegondra. Ny loharanon'ny ionisation electrospray (ESI) mafana dia miasa amin'ny voltazy famafazana 3.5 kV, mari-pana kapilary 250°C, fikorianan'ny rivotra ao anaty fonony 60 AU (singa tsy ara-dalàna), ary fikorianan'ny rivotra fanampiny 20 AU. 250°C. Ny family S dia napetraka amin'ny 60 AU.
Famakafakana anion chromatography-MS amin'ny asidra organika misy marika 13C. Ny metabolite precipitate sisa tavela (55μl) dia nohadihadiana tamin'ny fampiasana rafitra Dionex ion chromatography (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) mifandray amin'ny QE-HF mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Raha fintinina, 5μl amin'ny metabolite extract no nampidirina tao amin'ny tsanganana Dionex IonPac AS11-HC misy HPLC (2 mm × 250 mm, haben'ny poti 4μm, Thermo Fisher Scientific) tamin'ny fomba push-in partial loop miaraka amin'ny tahan'ny famenoana 1. ) Dionex IonPac AG11-HC guard column (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). Tazomina amin'ny 30°C ny mari-pana ao amin'ny tsanganana, ary apetraka amin'ny 6°C ny autosampler. Ampiasao ny cartridge potassium hydroxide misy rano deionized mba hamoronana gradient potassium hydroxide amin'ny alàlan'ny mpamokatra eluent. Fanasarahana ireo metabolita amin'ny tahan'ny fikorianan'ny 380μl/min, amin'ny fampiharana ity gradient manaraka ity: 0 hatramin'ny 3 minitra, 10 mM KOH; 3 hatramin'ny 12 minitra, 10 hatramin'ny 50 mM KOH; 12 hatramin'ny 19 minitra, 50 hatramin'ny 100 mM KOH; 19 hatramin'ny 21 minitra, 100 mM KOH; 21 hatramin'ny 21.5 minitra, 100 hatramin'ny 10 mM KOH. Naverina nampifandanjaina teo ambanin'ny 10 mM KOH nandritra ny 8.5 minitra ny tsanganana.
Afangaro amin'ny ranoka fanampiny isopropanol 150μl/min aorian'ny tsanganana ireo metabolites voadio ary avy eo alefa any amin'ny spectrometer de mass avo lenta miasa amin'ny fomba ionisation négatif. Manara-maso ny elanelan'ny mass manomboka amin'ny m/z 50 ka hatramin'ny 750 miaraka amin'ny famaha 60,000 ny MS. Napetraka amin'ny 1×106 ny AGC, ary tazonina amin'ny 100 ms ny fotoana ion ambony indrindra. Ny loharanon'ny ESI mafana dia niasa tamin'ny voltazy famafazana 3.5 kV. Ireto avy ny fikirana hafa amin'ny loharanon'ny ion: mari-pana kapila 275°C; fikorianan'ny entona ao anaty fonony, 60 AU; fikorianan'ny entona fanampiny, 20 AU amin'ny 300°C, ary ny fametrahana ny lens S amin'ny 60 AU.
Famakafakana angon-drakitra momba ny metabolites misy marika 13C. Ampiasao ny rindrambaiko TraceFinder (version 4.2, Thermo Fisher Scientific) ho an'ny famakafakana angon-drakitra momba ny tahan'ny isotope. Nohamarinin'ny singa azo itokisana ny maha-izy azy ny singa tsirairay ary nohadihadiana tsy miankina. Mba hanaovana famakafakana momba ny fanatsarana ny isotope, ny velaran'ny chromatogram ion nalaina (XIC) an'ny isotope 13C (Mn) tsirairay dia nalaina avy amin'ny [M + H] +, izay n ny isan'ny karbônina amin'ny singa kendrena, ampiasaina handinihana asidra amine na [MH] + ampiasaina handinihana ny anion. Ny fahamarinan'ny XIC dia latsaky ny dimy ampahany isaky ny tapitrisa, ary ny fahamarinan'ny RT dia 0.05 minitra. Ny famakafakana fanatsarana dia atao amin'ny alàlan'ny fikajiana ny tahan'ny isotope tsirairay hita amin'ny fitambaran'ny isotope rehetra amin'ny singa mifanaraka amin'izany. Ireo tahan'ny ireo dia omena ho toy ny isan-jaton'ny isotope tsirairay, ary ny valiny dia aseho ho toy ny fanatsarana isan-jaton'ny molar (MPE), araka ny voalaza teo aloha (42).
Nohafohezina tao anaty methanol mangatsiaka 80% (v/v) ny pellet neuron mangatsiaka, novolena tamin'ny vortex, ary notehirizina tamin'ny -20°C nandritra ny 30 minitra. Avereno amin'ny vortex ny santionany ary afangaro amin'ny +4°C mandritra ny 30 minitra. Notsindrina tamin'ny centrifuge tamin'ny 21.000 g nandritra ny 5 minitra tamin'ny 4°C ny santionany, ary avy eo dia nangonina ny supernatant vokarina ary nohamainina tamin'ny fampiasana SpeedVac concentrator tamin'ny 25°C ho an'ny fanadihadiana manaraka. Araka ny voalaza etsy ambony, dia natao tamin'ny asidra amine amin'ireo sela voasokajy ny fanadihadiana LC-MS. Tamin'ny fampiasana TraceFinder (version 4.2, Thermo Fisher Scientific), dia natao ny fanadihadiana angon-drakitra tamin'ny fampiasana ny faobe monoisotopic an'ny fitambarana tsirairay. Ny fanitsiana ny quantile ny angon-drakitra metabolite dia natao tamin'ny fampiasana ny fonosana rindrambaiko preprocessCore (57).
Fiomanana amin'ny silaka. Nomena fanatoranana haingana tamin'ny gazy karbonika ny totozy ary notapahina ny lohany, nesorina haingana tamin'ny karandoha ny atidoha, ary nampiasaina ny antsy mangovitra feno ranomandry (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemaina) mba hanapahana azy ho fizarana sagittal 300 ka hatramin'ny 375 μm. Fangaroana gazy karbonika mangatsiaka (95% O2 sy 5% CO2) Ca2 + ACSF ambany (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 ary 6.0 mM MgCl2. Ampifanaraho amin'ny pH 7.4 sy 310 hatramin'ny 330 mOsm). Afindrao ao anaty efitrano misy Ca2 + ACSF ambony kokoa (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 4.0 mM CaCl2 ary mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 sy 310 hatramin'ny 320 mOsm) ireo silaka atidoha azo. Tehirizo mandritra ny 20 ka hatramin'ny 30 minitra ireo silaka mba hahafahana mamerina azy ireo amin'ny laoniny alohan'ny handraisana an-tsoratra.
fandraketana. Sehatra mikraoskaopy misy efitrano fandraketana raikitra sy lantihy objective immersion 20x (Scientifica) no nampiasaina tamin'ny fandraketana rehetra. Ireo sela Purkinje heverina fa mety dia nofantarina tamin'ny alalan'ny (i) haben'ny vatana, (ii) toerana anatomika misy ny cerebellum, ary (iii) fanehoana ny gène mpanao tatitra mtYFP fluorescent. Ny pipette patch misy fanoherana ny tendrony 5 ka hatramin'ny 11 megohms dia sintonina amin'ny alalan'ny kapilary fitaratra borosilicate (GB150-10, 0.86 mm × 1.5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Alemaina) sy pipette horizontal Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Ny fandraketana rehetra dia natao tamin'ny alalan'ny ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH, Tam, Alemaina), izay fehezin'ny rindrambaiko Signal (version 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). Noraketina tamin'ny tahan'ny santionany 12.5 kHz ny andrana. Sivana amin'ny alalan'ny sivana Bessel fohy roa miaraka amin'ny frequence cutoff 1.3 sy 10 kHz tsirairay avy ny famantarana. Ny capacitance an'ny membrane sy ny pipette dia oneran'ny circuit compensation amin'ny fampiasana ny amplifier. Ny andrana rehetra dia natao teo ambany fifehezan'ny fakantsary Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Alemaina), izay fehezin'ny rindrambaiko Hokawo (version 2.8, Hamamatsu, Gerden, Alemaina).
Fandaminana sy famakafakana mahazatra ny sela manontolo. Alohan'ny handraisana an-tsoratra dia fenoy ranoka anatiny misy ireto akora manaraka ireto ny pipette: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM potassium gluconate, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosine triphosphate (GTP) (Na) ary 10.0 mM creatinine phosphate izay namboarina ho pH 7.25, ary 290 mOsm (sucrose) ny tsindry osmotika. Avy hatrany rehefa avy nampihatra hery 0 pA handrava ny fonon-taolana dia norefesina ny mety ho vitan'ny fonon-taolana. Ny fanoherana ny fidirana dia refesina amin'ny alàlan'ny fampiharana courant hyperpolarized -40, -30, -20, ary -10 pA. Refeso ny haben'ny valin'ny voltazy ary ampiasao ny lalàn'i Ohm mba hikajiana ny fanoherana ny fidirana. Noraisina tao anaty "voltage clamp" nandritra ny 5 minitra ny hetsika tampoka, ary voafaritra sy norefesina tao amin'ny Igor Pro (version 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, Etazonia) ny sPSC tamin'ny fampiasana script recognition semi-automatique. Ny fiolahana IV sy ny courant steady-state dia refesina amin'ny alàlan'ny famehezana ny bateria amin'ny potentials samihafa (manomboka amin'ny -110 mV) ary mampitombo ny voltazy amin'ny dingana 5 mV. Notsapaina tamin'ny fampiharana courant depolarizing ny famokarana AP. Afehezo amin'ny -70 mV ny sela sady mampihatra pulse courant depolarizing. Amboary misaraka ny haben'ny dingana tsirairay amin'ny singa fandraisam-peo (10 hatramin'ny 60 pA). Kajio ny fatran'ny AP ambony indrindra amin'ny fanisana tanana ny pulse spikes izay miteraka ny fatran'ny AP ambony indrindra. Ny tokonam-baravaran'ny AP dia dinihina amin'ny alàlan'ny fampiasana ny derivative faharoa amin'ny pulse depolarization izay miteraka AP iray na maromaro voalohany.
Fandrindrana sy famakafakana ny patch misy lavaka. Manaova fandraketana patch misy lavaka amin'ny alàlan'ny protocole mahazatra. Ampiasao pipette tsy misy ATP sy GTP izay tsy misy ireto akora manaraka ireto: 128 mM gluconate K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA ary 2 mM MgCl2, ary amboary amin'ny pH 7.2 (mampiasa KOH). Tsy ampidirina ao anaty vahaolana intracellular ny ATP sy GTP mba hisorohana ny fidiran'ny fonon'ny sela tsy voafehy. Fenoina vahaolana anatiny misy amphotericin (eo amin'ny 200 hatramin'ny 250μg/ml eo ho eo; G4888, Sigma-Aldrich) ny pipette patch mba hahazoana fandraketana patch misy lavaka. Levona tao anaty dimethyl sulfoxide ny amphotericin (fifantohana farany: 0.1 hatramin'ny 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Tsy nisy fiantraikany lehibe teo amin'ny neurons nodinihina ny fifantohan'ny DMSO nampiasaina. Nandritra ny dingan'ny fanindriana, dia nojerena tsy tapaka ny fanoherana ny fantsona (Ra), ary natomboka ny fanandramana rehefa avy niorina ny amplitude an'ny Ra sy ny AP (20-40 minitra). Refesina ao anaty clamp voltase sy/na courant mandritra ny 2 ka hatramin'ny 5 minitra ny asa tampoka. Natao tamin'ny fampiasana Igor Pro (version 7.05.2, WaveMetrics, Etazonia), Excel (version 2010, Microsoft Corporation, Redmond, Etazonia) ary GraphPad Prism (version 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) ny famakafakana angon-drakitra. Mba hamantarana ny AP tampoka, dia ampiasaina ny plug-in NeuroMatic v3.0c an'ny IgorPro. Fantaro ho azy ny AP amin'ny fampiasana tokonam-baravarana nomena, izay amboarina tsirairay isaky ny firaketana. Amin'ny fampiasana ny elanelam-potoanan'ny spike, farito ny fatran'ny spike miaraka amin'ny fatran'ny spike eo no ho eo ambony indrindra sy ny fatran'ny spike antonony.
Fitokanana PN. Amin'ny alàlan'ny fampifanarahana amin'ny protocole navoaka teo aloha, dia nodiovina avy amin'ny cerebellum an'ny totozy ny PN tamin'ny dingana voafaritra (58). Raha fintinina, ny cerebellum dia notapatapahina sy notapatapahina tao anaty fitaovana fisarahana mangatsiaka be [tsy misy HBSS Ca2+ sy Mg2+, ampiana glucose 20 mM, penicillin (50 U/ml) ary streptomycin (0.05 mg/ml)], ary avy eo dia levonina ao anaty papain ny fitaovana [HBSS, ampiana 1-cysteine·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) ary deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml)] Tsaboina mandritra ny 30 minitra amin'ny 30°C. Sasao aloha ny sela ao anaty ranoka HBSS misy moka atody (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) ary DNase (0.1 mg/ml) amin'ny mari-pana ao an-trano mba hisorohana ny fandevonan-kanina anzima, ary avy eo ao anaty ranoka HBSS misy gliokaozy 20 mM. Totoina moramora ao anaty ranoka HBSS, penisilinina (50 U/ml), streptomycin (0.05 mg/ml) ary DNase (0.1 mg/ml) ny sela tsirairay. Ny fampiatoana sela vokarina dia nosivanina tamin'ny alalan'ny sivana sela 70μm, avy eo dia nopotehina tamin'ny alalan'ny centrifugation (1110 rpm, 5 minitra, 4°C) ireo sela ary naverina natsipy tao anaty ranoka fanasokajiana [HBSS, ampiana gliokaozy 20 mM, 20% foetus bovine) serum, penisilinina (50 U/ml) ary streptomycin (0.05 mg/ml)]; tombano ny fahaveloman'ny sela amin'ny propidium iodide ary amboary ny hakitroky ny sela ho 1×106 hatramin'ny 2×106 sela/ml. Talohan'ny cytometry mikoriana, dia nosivanina tamin'ny alalan'ny sivana sela 50 μm ny fampiatoana.
Sitomètre mikoriana. Natao tamin'ny 4°C ny fanasokajiana sela tamin'ny fampiasana milina FACSAria III (BD Biosciences) sy rindrambaiko FACSDiva (BD Biosciences, version 8.0.1). Nosokajiana tamin'ny fampiasana nozzle 100 μm teo ambanin'ny tsindry 20 psi tamin'ny tahan'ny ~2800 hetsika/segondra ny fampiatoana sela. Koa satria ny fepetra mahazatra momba ny gating (haben'ny sela, ny fanavakavahana bimodal, ary ny toetran'ny fiparitahana) dia tsy afaka miantoka ny fisarahana marina ny PN amin'ny karazana sela hafa, ny paikady gating dia napetraka mifototra amin'ny fampitahana mivantana ny hamafin'ny YFP sy ny autofluorescence ao amin'ny mitoYFP+ ​​​​sy ny totozy mitoYFP − fanaraha-maso. Ny YFP dia mientanentana amin'ny alàlan'ny taratra amin'ny santionany amin'ny tsipika laser 488 nm, ary ny famantarana dia hita amin'ny fampiasana sivana band pass 530/30 nm. Ao amin'ny totozy mitoYFP+, ny tanjaky ny gène reporter Rosa26-mitoYFP dia ampiasaina ihany koa mba hanavahana ny sombin-taolana neuronal sy ny axon. Ahetsehina amin'ny laser mavo 561 nm ny 7-AAD ary hita amin'ny sivana bandpass 675/20 nm mba hanesorana ireo sela maty. Mba hanasarahana ireo astrocytes miaraka amin'izay, dia nolokoina tamin'ny ACSA-2-APC ny fampiatoana ny sela, avy eo dia notarafina tamin'ny tsipika laser 640 nm ny santionany, ary nampiasaina ny sivana bandpass 660/20 nm mba hamantarana ny famantarana.
Nopotehina tamin'ny alalan'ny centrifugation (1110 rpm, 5 minitra, 4°C) ireo sela voaangona ary notehirizina tamin'ny -80°C mandra-pahatongan'ny fampiasana azy. Nosokajiana tamin'io andro io ihany ireo totozy Mfn2cKO sy ireo zanany mba hampihenana ny fiovaovan'ny fomba fiasa. Natao tamin'ny alalan'ny rindrambaiko FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, Etazonia) ny fampisehoana sy ny famakafakana ny angon-drakitra FACS.
Araka ny voalaza etsy ambony (59), ny PCR amin'ny fotoana tena izy dia ampiasaina hanasarahana ny ADN avy amin'ireo neurons voasokajy ho an'ny fandrefesana mtDNA manaraka. Ny linearity sy ny threshold sensitivity dia nosedraina voalohany tamin'ny alàlan'ny fampiasana qPCR amin'ny isan'ny sela samihafa. Raha fintinina, angony ny 300 PN ao anaty lysis buffer misy 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 ary proteinase K (200 ng/ml) ary ambolena amin'ny 55°C mandritra ny 120 minitra. Novelomina tamin'ny 95°C nandritra ny 10 minitra ireo sela mba hahazoana antoka fa tsy miasa tanteraka ny proteinase K. Amin'ny fampiasana TaqMan probe (Thermo Fisher) manokana ho an'ny mt-Nd1, ny mtDNA dia norefesina tamin'ny alàlan'ny semi-quantitative PCR tao amin'ny rafitra 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific). Siansa, laharana katalaogy Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, laharana katalaogy AIVI3E8) ary 18S (Thermo Fisher Scientific, laharana katalaogy Hs99999901_s1).
Fanomanana santionan'ny proteome. Amin'ny fanafanana ny vahaolana amin'ny 95°C mandritra ny 10 minitra sy ny fanafanana azy amin'ny alalan'ny sonikation, ao amin'ny lysis buffer [6 M guanidine chloride, 10 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride, 10 mM chloroacetamide ary 100 mM tris-Lyse mangatsiaka neuron pellets ao amin'ny HCl]. Ao amin'ny Bioruptor (Diagenode) mandritra ny 10 minitra (30 segondra pulse / 30 segondra fiatoana). Nohavaozina 1:10 tao anaty 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ny santionany, afangaro amin'ny 300 ng trypsin gold (Promega), ary notehirizina nandritra ny alina tamin'ny 37°C mba hahazoana fandevonan-kanina tanteraka. Tamin'ny andro faharoa, notsindrina tamin'ny centrifuge tamin'ny 20.000 g nandritra ny 20 minitra ny santionany. Nohavaozina tamin'ny asidra formika 0.1% ny supernatant, ary nesorina ny sira tamin'ny StageTips vita manokana. Nohamainina tamin'ny fitaovana SpeedVac (Eppendorf concentrator miampy 5305) tamin'ny 45°C ny santionany, ary avy eo dia nahantona tao anaty asidra formika 0.1% ny peptide. Nomanin'ny olona iray ihany niaraka ireo santionany rehetra. Mba handinihana ny santionan'ny astrocyte, dia nasiana marika tandem mass tag (TMT10plex, laharana katalaogy 90110, Thermo Fisher Scientific) ny peptide 4 μg tsy nasiana sira, miaraka amin'ny tahan'ny peptide amin'ny reagent TMT 1:20. Ho an'ny marika TMT, dia naverina nahantona tao anaty ACN tsy misy rano 70 μl ny reagent TMT 0.8 mg, ary naverina natambatra ho 9 μl ny TEAB 0.1 M (triethylammonium bicarbonate) ny peptide maina, izay nampiana 7 μl ny reagent TMT tao anaty ACN. Ny fifantohana dia 43.75%. Rehefa afaka 60 minitra niorenana, dia novonoina tamin'ny hydroxylamine 2 μl 5% ny fihetsika. Nangonina ireo peptide misy marika, nohamainina, naverina natsipy tao anaty asidra formika 0.1% (FA) 200μl, nozaraina roa, ary avy eo nesorina ny sira tamin'ny fampiasana StageTips vita manokana. Tamin'ny fampiasana ny chromatograph liquide ultra high performance UltiMate 3000 (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph), ny iray amin'ireo tapany roa dia nozaraina tamin'ny tsanganana chromatographic Acquity 1mm x 150mm feno poti-javatra C18 130Å1.7μm (Waters, catalog No. SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Saraho amin'ny tahan'ny fikorianan'ny 30μl/min ny peptide, saraho amin'ny buffer B 1% hatramin'ny 50% mandritra ny 85 minitra miaraka amin'ny gradient tsikelikely 96 minitra, avy amin'ny buffer B 50% hatramin'ny 95% mandritra ny 3 minitra, avy eo 8 minitra ho an'ny Buffer B 95%. Ny buffer A dia ACN 5% sy bikarbonate ammonium 10 mM (ABC), ary ny buffer B dia ACN 80% sy ABC 10 mM. Angony isaky ny 3 minitra ny ampahany ary ampiarahina ho vondrona roa (1 + 17, 2 + 18, sns.) ary maina amin'ny "centrifuge" tsy misy rivotra.
Fanadihadiana LC-MS/MS. Ho an'ny spektrometria faobe, ireo peptide (laharana r119.aq) dia nosarahina tamin'ny tsanganana analytika PicoFrit 25 sm sy 75 μm ny savaivony anatiny (lentille objective vaovao, laharan'ny ampahany PF7508250) misy fitaovana ReproSil-Pur 120 C18-AQ 1.9 μm (Dr. Maisch, mat), Ampiasao ny EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Alemaina). Notazonina tamin'ny 50°C ny tsanganana. Ny buffers A sy B dia asidra formika 0.1% ao anaty rano ary asidra formika 0.1% ao anaty ACN 80%. Ny peptides dia nosarahina tamin'ny buffer B 6% ka hatramin'ny 31% nandritra ny 65 minitra ary tamin'ny buffer B 31% ka hatramin'ny 50% nandritra ny 5 minitra miaraka amin'ny gradient 200 nl/min. Ireo peptides voadio dia nohadihadiana tamin'ny spektrometera faobe Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Ny fandrefesana m/z an'ny peptide precursor dia atao amin'ny famaha 120.000 eo anelanelan'ny 350 sy 1500 m/z. Amin'ny fampiasana angovo fifandonana voarindra 27%, ny precursor matanjaka indrindra miaraka amin'ny toetry ny fiampangana 2 hatramin'ny 6 no voafantina ho an'ny fizarazarana C trap dissociation (HCD) angovo avo lenta. Ny fotoana tsingerina dia napetraka ho 1 s. Ny sandan'ny m/z an'ny sombin-peptide dia norefesina tao amin'ny ion trap tamin'ny fampiasana ny lasibatra AGC kely indrindra 5 × 104 sy ny fotoana tsindrona ambony indrindra 86 ms. Taorian'ny fizarazarana, ny precursor dia napetraka tao amin'ny lisitry ny fanilihana mavitrika mandritra ny 45 s. Nosarahina tamin'ny tsanganana Acclaim PepMap 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, laharana katalaogy 164942) ireo peptide misy marika TMT, ary nohadihadiana tamin'ny spektrometera Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) misy fitaovana ionina asimetrika onjam-peo avo lenta (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) ny spektra fifindra-monina izay miasa amin'ny voltazy fanonerana roa −50 sy −70 V. Ny MS3 nofantenana mifototra amin'ny mpialoha lalana ny fampifanarahana dia ampiasaina amin'ny fandrefesana ny famantarana ionina tatitra TMT. Ny fisarahana peptide dia natao tamin'ny EASY-nLC 1200, tamin'ny fampiasana elution gradient linear 90%, miaraka amin'ny fifantohana buffer 6% hatramin'ny 31%; ny buffer A dia 0.1% FA, ary ny buffer B dia 0.1% FA ary 80% ACN. Ny tsanganana fanadihadiana dia miasa amin'ny 50°C. Ampiasao ny FreeStyle (version 1.6, Thermo Fisher Scientific) mba hanasarahana ny rakitra tany am-boalohany araka ny voltazy fanonerana FAIMS.
Famantarana sy fandrefesana proteinina. Nampiasa ny motera fikarohana Andromeda mitambatra, ny angon-drakitra tany am-boalohany dia nohadihadiana tamin'ny fampiasana ny MaxQuant version 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Ho fanampin'ny filaharan'ny Cre recombinase sy YFP azo avy amin'ny Aequorea victoria, dia notadiavina ny spektra sombin-peptide mba hahitana ny filaharana kanonika sy ny filaharan'ny isoform an'ny proteome referansa amin'ny totozy (Proteome ID UP000000589, nalaina avy amin'ny UniProt tamin'ny Mey 2017). Ny oksidasiona methionine sy ny acetylation proteinina N-terminal dia napetraka ho fanovana miovaova; ny methylation cysteine ​​​​carbamoyl dia napetraka ho fanovana raikitra. Ny masontsivana fandevonan-kanina dia napetraka ho "specificity" sy "trypsin/P". Ny isan'ny peptides sy peptides razor kely indrindra ampiasaina amin'ny famantarana proteinina dia 1; ny isan'ny peptides tokana kely indrindra dia 0. Eo ambanin'ny fepetran'ny sarintany peptide mifanandrify, ny tahan'ny famantarana proteinina dia 0.01. Alefa ny safidy "Peptide Faharoa". Ampiasao ny safidy "match between runs" mba hamindrana ny famantarana mahomby eo amin'ireo rakitra tany am-boalohany samihafa. Ampiasao ny isa LFQ farafahakeliny 1 ho an'ny fandrefesana tsy misy marika (LFQ) (60). Ny hamafin'ny LFQ dia sivana ho an'ny soatoavina manan-kery roa farafahakeliny ao anatin'ny vondrona genotype iray farafahakeliny isaky ny fotoana, ary alaina avy amin'ny fizarana ara-dalàna misy sakany .0.3 ary midina 1.8. Ampiasao ny sehatra informatika Perseus (https://maxquant.net/perseus/) sy R (https://r-project.org/) mba handinihana ny valin'ny LFQ. Ny fitsapana t antonony roa avy amin'ny fonosana rindrambaiko limma dia nampiasaina ho an'ny fanadihadiana ny fanehoan-kevitra samihafa (61). Ny fanadihadiana angon-drakitra fikarohana dia atao amin'ny fampiasana ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally ary pheatmap. Ny angon-drakitra proteomics mifototra amin'ny TMT dia nohadihadiana tamin'ny fampiasana MaxQuant version 1.6.10.43. Mitadiava angon-drakitra momba ny proteomics manta avy amin'ny tahiry angon-drakitra momba ny proteomics olombelona an'ny UniProt, izay nalaina tamin'ny Septambra 2018. Ny fanadihadiana dia ahitana ny singa fanitsiana ny fahadiovan'ny isotope nomen'ny mpanamboatra. Ampiasao ny limma ao amin'ny R ho an'ny fanadihadiana ny fanehoana samihafa. Ny angon-drakitra tany am-boalohany, ny valin'ny fikarohana momba ny tahiry angon-drakitra, ary ny fomba fiasa sy ny valin'ny fanadihadiana angon-drakitra dia voatahiry ao amin'ny fiaraha-miasa ProteomeXchange amin'ny alàlan'ny tahiry mpiara-miasa PRIDE miaraka amin'ny famantarana ny andian-drakitra PXD019690.
Manatsara ny fanadihadiana ny fanamarihana ara-asa. Nampiasaina ny fitaovana Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) mba hamaritana ny harenan'ny teny fanamarihana ara-asa amin'ny angon-drakitra amin'ny herinandro faha-8 (Sary 1). Raha fintinina, ny lisitry ny proteinina azo avy amin'ny fanadihadiana angon-drakitra LC-MS/MS (tandem mass spectrometry) dia ampiasaina miaraka amin'ireto fepetra sivana manaraka ireto: Ny Mus musculus dia voafantina ho karazana sy fototra, ary ny sokajy dia mampiseho fa ny sandan'ny P novain'i Benjamini ho an'ny fanatsarana 0.05 na latsaka dia heverina ho manan-danja. Ho an'ity grafika ity, ny sokajy dimy ambony indrindra amin'ny vondrona tsirairay mifototra amin'ny sandan'ny P novaina dia aseho. Amin'ny fampiasana fitsapana-t marobe, amin'ny fampiasana ny programa fanamafisana linear roa dingana an'i Benjamini, Krieger, ary Yekutieli (Q = 5%), ny fanadihadiana ny fanehoana proteinina amin'ny fotoana dia atao amin'ireo kandidà manan-danja voafaritra amin'ny sokajy tsirairay, ary ny andalana tsirairay dia hadihadiana misaraka. Tsy ilaina ny mampiasa SD mitovy.
Mba hampitahana ny valin'ity fanadihadiana ity amin'ny angon-drakitra navoaka sy hamoronana kisarisary Venn ao amin'ny Sary 1, dia nampiarahinay tamin'ny fanamarihana MitoCarta 2.0 (24) ny lisitry ny proteinina quantitative. Ampiasao ny fitaovana an-tserasera Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) mba hamoronana ny kisarisary.
Raha mila fanazavana amin'ny antsipiriany momba ny fomba fiasa statistika ampiasaina amin'ny famakafakana proteomika, dia jereo ny fizarana mifandraika amin'izany ao amin'ny Fitaovana sy Fomba. Ho an'ny andrana hafa rehetra, ny fampahalalana amin'ny antsipiriany dia hita ao amin'ny fanazavana mifandraika amin'izany. Raha tsy misy voalaza manokana, ny angon-drakitra rehetra dia aseho amin'ny salan'isa ± SEM, ary ny famakafakana statistika rehetra dia natao tamin'ny fampiasana rindrambaiko GraphPad Prism 8.1.2.
Raha mila fitaovana fanampiny ho an'ity lahatsoratra ity dia jereo ny http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Lahatsoratra azon'ny rehetra idirana ity, zaraina araka ny fepetran'ny Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike, izay mamela ny fampiasana, fizarana ary famokarana amin'ny fitaovana rehetra, raha mbola tsy natao ho an'ny tombony ara-barotra ny fampiasana farany ary ny fototra iorenan'ny asa tany am-boalohany dia marina. Referansa.
Fanamarihana: Ny adiresy mailakao ihany no angatahinay aminao mba hahafantaran'ilay olona atolotrao ny pejy fa tianao ho hitany ilay mailaka ary tsy spam izany. Tsy haka adiresy mailaka izahay.
Ity fanontaniana ity dia ampiasaina hitsapana raha mpitsidika ianao ary hisorohana ny fandefasana spam mandeha ho azy.
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Ny fanadihadiana proteomika momba ny neurônina tsy miasa tsara dia naneho fa miasa ny fandaharan'asa metabolika mba hanoherana ny fahasimban'ny neurodegeneration.
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Ny fanadihadiana proteomika momba ny neurônina tsy miasa tsara dia naneho fa miasa ny fandaharan'asa metabolika mba hanoherana ny fahasimban'ny neurodegeneration.
©2020 American Association for the Advancement of Science. Zo rehetra voatokana. Ny AAAS dia mpiara-miasa amin'ny HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ary COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.