Ankehitriny†Adiresy ankehitriny: OX11 0DE, UK, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Ny complexe 1 (RC-LH1) izay manangona hazavana ao amin'ny foibem-pihetsehana no singa fototra amin'ny fotosintetika amin'ny bakteria phototrophique volomparasy. Nampiditra rafitra mikroskopia cryo-elektronika roa amin'ny complexe RC-LH1 avy amin'ny Rhodopseudomonas palustris izahay. Ny rafitra 2.65-Å amin'ny complexe RC-LH114-W dia misy tadivavarana LH1 subunit 14 manodidina ny RC, izay tapahin'ny proteinina W, raha toa kosa ny complexe tsy misy proteinina-W dia fitambarana RC tanteraka voahodidin'ny RC. Tadivavarana LH1 subunit 16 mihidy. Ny fampitahana ireo rafitra ireo dia manome fahatakarana ny dinamikan'ny quinone ao amin'ny complexe RC-LH1, anisan'izany ny fiovana tsy voafaritra teo aloha rehefa mifamatotra amin'ny quinone eo amin'ny toerana RC QB, ary koa ny toerana misy ny toerana mifamatotra amin'ny quinone fanampiny, izay manampy amin'ny fampitana azy ireo any amin'ny RC. Ny rafitra miavaka amin'ny proteinina W dia misoroka ny fanakatonana ny tadivavarana LH1, ka mamorona fantsona hanafainganana ny fifanakalozana quinone/quinolone.
Afaka manohana saika ny fiainana rehetra eto an-tany ny angovo omen'ny fotosintezy, ary manana fahafahana lehibe ho an'ny bioteknolojian'ny masoandro. Sady mampiroborobo ny fotosintezy manerantany, ny bakteria phototrophique volomparasy dia mampiseho fomba angovo sy fahaiza-manao metabolika isan-karazany. Afaka misoroka ny fotosintezy izy ireo ary mitombo ho bakteria heterotrophique ao anaty haizina, afaka manamboatra azota sy gazy karbonika, mamokatra hidrôzenina, ary manimba ireo akora aromatika (1-3). Mba hanomezana angovo ho an'ireo dingana ireo, ny hazavana dia tsy maintsy avadika haingana sy mahomby ho angovo simika. Manomboka ity dingana ity rehefa mandray ny hazavana ny antenne mpanangona hazavana ary mamindra ny angovo voafandrika any amin'ny foibe fanehoan-kevitra (RC), ka manomboka ny fisarahana fiampangana (4 - 7). Ny singa fototra amin'ny fotosintezy ao amin'ny bakteria phototrophique volomparasy dia ahitana RC karazana 2, voahodidin'ny complexe fanangonana hazavana 1 (LH1), mamorona ny complexe fototra RC-LH1. Ny LH1 dia miforona amin'ny andiana heterodimer αβ miolikolika, izay samy mifamatotra amin'ny molekiola klorofila bakteria roa (BChl) a sy carotenoida iray na roa (8-12). Ny antenne LH1 tsotra indrindra dia misy heterodimer αβ 16 na 17 manodidina ny RC (9-13) ao anaty tadivavarana mihidy, fa amin'ny complexes fototra hafa, ny peptides transmembrane dia manapaka ny fitohizan'ny LH1 manodidina, ka mampiroborobo ny fiparitahan'ny quinol/quinone eo anelanelan'ny RC sy ny complexe cytochrome bc1 (11, 13-15). Ny zavamaniry phototrophic volomparasy Rhodopseudomonas (Rps.) dia zavamananaina modely izay afaka mahatakatra ny famindrana angovo sy elektrôna izay manohana ny photosynthesis. Ny rafitra kristaly voalohany amin'ny Rps. Ny modely amin'ny complexe palustris RC-LH1 dia RC, voahodidin'ny tadivavarana LH1 heterodimeric 15, izay tapaka amin'ny proteinina tsy fantatra antsoina hoe "Protein W" (14). Ny Protein-W dia fantatra taty aoriana ho RPA4402, izay proteinina 10.5kDa tsy voafaritra miaraka amin'ny helices transmembrane telo (TMH) vinavinaina (16). Manolo-kevitra ny hanova ny anaran'ny fototarazo rpa4402 izay mandika ny proteinina W ho pufW izahay mba hifanaraka amin'ny anarana ampiasaina amin'ny fototarazo mandika ny vondrona RC-L, M (pufL, pufM) sy LH1α, β (pufA, pufB). Mahaliana fa ny proteinina-W dia hita ao amin'ny 10% eo ho eo amin'ny RC-LH1, izay mampiseho fa ny Rps. palustris dia mamokatra complexe RC-LH1 roa samy hafa. Eto izahay dia mitatitra ny rafitra cryo-EM (cryo-EM) avo lenta amin'ny complexe fototra roa, ny iray misy proteinina W sy heterodimer 14 αβ, ny iray tsy misy proteinina W ary tadivavarana LH1 Heterodimer 16 mihidy. Ny rafitray dia maneho fiovana tsikelikely amin'ny fahatakarana ny complexe RC-LH1 an'ny Rps. palustris, satria efa nandinika ny mponina homogeneous amin'ny variant tsirairay izahay ary manana resolution ampy hanendrena mazava tsara ny peptide tsirairay sy ny pigment mifamatotra ary ny lipida sy quinones mifandraika amin'izany. Ny fampitahana ireo rafitra ireo dia mampiseho fa ireo proteinina TMH telo-W izay tsy hita tao amin'ny complexe RC-LH1 hafa hatreto dia mamorona fantsona quinone mba hanafainganana ny fifanakalozana quinone/quinolone. Maro ireo toerana fifamatoran'ny lipida sy quinone voatahiry no hita, ary naneho fiovana vaovao momba ny endriny izahay taorian'ny fampiarahana ny quinone sy RC, izay mety ho mety amin'ny photosystem II (PSII) RC an'ny zavamananaina phototrophique misy oksizenina. Ny zavatra hitanay dia manome fahatakarana vaovao momba ny kinetika fifamatoran'ny quinone/quinolone sy ny fifanakalozana ao amin'ny complexe fototra RC-LH1 an'ny bakteria phototrophique volomparasy.
Mba hanamorana ny fandalinana amin'ny antsipiriany ireo fitambarana roa hita ao amin'ny Rps. palustris, dia nosarahinay tamin'ny fomba biochemika ny RC-LH1 tsirairay. Ny fitambarana tsy ampy proteinina W (antsoina eto hoe ΔpufW) dia nodiovina avy amin'ny karazana tsy manana ny fototarazo pufW (16), ary fitambarana RC-LH1 iray ihany no azo vokarina. Ny fitambarana misy proteinina W dia vokarin'ny karazana iray. Ny proteinina W an'ity karazana ity dia novaina tamin'ny marika 10x His eo amin'ny C-terminus-ny, mba hahafahana mampiaraka tsara ny fitambarana misy proteinina W amin'ny ankamaroan'ny proteinina W tsy ampy amin'ny alàlan'ny fampiatoana ny metaly. Ny fitambarana dia nosarahina tsara (16) Affinity Chromatography (IMAC).
Araka ny aseho amin'ny Sary 1, ireo complexe roa ireo dia misy singa telo RC (RC-L, RC-M ary RC-H) voahodidin'ny antenne LH1. Ny rafitra 2.80-A an'ny complexe tsy misy protein-W dia mampiseho heterodimer αβ 16, mamorona tadivavarana LH1 mihidy manodidina ny RC, izay antsoina etoana hoe complexe RC-LH116. Ny rafitra 2.65Å an'ny complexe misy protein-W dia manana LH1 heterodimer 14 izay tapahin'ny protein-W, izay antsoina etoana hoe RC-LH114-W.
(A sy B) Fanehoana ny ety ambonin'ny fitambarana. (C sy D) Loko mifamatotra aseho amin'ny tsorakazo. (E sy F) Ireo fitambarana hita avy amin'ny ety ambonin'ny sitoplasmika dia manana peptides sy singa LH1 aseho amin'ny sary an-tsary, ary laharana manaraka ny fihodin'ny famantaranandro avy amin'ny elanelan'ny proteinina-W [mifanaraka amin'ny laharana Rba. fitambarana sphaeroides (13)]. Ho an'ny LH1-α, mavo ny lokon'ny singa proteinina; ho an'ny LH1-β, manga ny lokon'ny singa proteinina; ho an'ny proteinina-W, mena ny proteinina; ho an'ny RC-H, cyan izy; ho an'ny RC-L, volomboasary; ho an'ny RC-M, magenta. Ireo kofaktora dia aseho amin'ny tsorakazo, maitso maneho ny molekiola BChl sy BPh a, volomparasy maneho ny carotenoids, ary mavo maneho ny molekiola UQ10. (G sy H) Fijery lehibe kokoa ny elanelan'ny proteinina-W ao amin'ny faritra mitovy amin'ny fitambarana RC-LH114-W (G) sy ny fitambarana RC-LH116 (H). Aseho amin'ny endrika famenoana toerana ireo kofaktora, ary aseho amin'ny loko manga ny quinone misy kelasitra. Asongadin'ny tsipika manga misy tsipika miendrika teboka ny elanelan'ny proteinina-W ao amin'ny (G), ary ireo lavaka kely izay iparitahan'ny quinone/quinolol eo amin'ny peratra LH116 dia asongadin'ny tsipika mainty misy tsipika miendrika teboka ao amin'ny (H).
Ny Sary 1 (A sy B) dia mampiseho ny RC voahodidin'ny andiana heterodimer LH1αβ misokatra na mihidy, izay samy mifamatotra amin'ny BChl roa sy carotenoid iray (Sary 1, C sy D). Ny fanadihadiana teo aloha dia naneho fa Rps no complexe LH1. Ao amin'ny lalan'ny biosynthetic an'ny spirulina xanthin, ireo karazana ireo dia misy vondron'olona mifangaro amin'ny carotenoid (17). Na izany aza, ny spiropyrroxanthin no carotenoid manjaka ary mahafa-po ny hakitrony. Noho izany, nisafidy ny hanao modely spiroxanthin amin'ny toerana fifamatoran'ny LH1 rehetra izahay. Ny polypeptide alpha sy beta dia TMH tokana misy faritra ivelany fohy misy membrane (Sary 1, A, B, E, ary F). Na dia tsy hita aza ny hakitroky ny residues 17 eo amin'ny C-terminus, ny polypeptide alpha dia notapatapahina avy amin'ny Met1 mankany Ala46 amin'ireo complexe roa ireo. Ny polypeptide β dia nihena avy amin'ny Gly4 mankany Tyr52 ao amin'ny RC-LH116, ary avy amin'ny Ser5 mankany Tyr52 ao amin'ny RC-LH114-W. Tsy nisy hakitroky ny residu N-terminal 3 na 4 na C-terminal 13 hita (Sary S1). Ny fanadihadiana spectrometry faobe tamin'ny complexe RC-LH1 mifangaro nomanina avy amin'ny karazana wild-type dia naneho fa ny faritra tsy hita dia vokatry ny fizarazarana heterologous an'ireo peptide ireo (Sary S1 sy S2). Hita ihany koa ny formylation N-terminal an'ny α-Met1 (f). Ny fanadihadiana dia naneho fa ny α-peptide dia misy residu fMet1 hatramin'ny Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, ary ny β-peptide dia misy residu Ser2 hatramin'ny Ala53, izay mifanaraka tsara amin'ny sarintany hakitroky EM amin'ny mari-pana ambany.
Ny fandrindrana ny α-His29 sy ny β-His36 dia mahatonga ny BChls hifanatrika; ny heterodimer αβ tsirairay dia miangona amin'ireo mpiara-monina aminy mba hamorona tadivavarana misokatra (RC-LH114-W) na tadivavarana mihidy (RC-LH116) manodidina ny RC The exciton coupled pigment array (Sary 1, C sy D). Raha ampitahaina amin'ny tarika 877 nm an'ny RC-LH114-W, ny fiovan'ny mena absorption 880 nm an'ny RC-LH116 dia 3 nm (Sary 2A). Na izany aza, saika mitovy ny spectrum dichroism boribory (Sary 2B), izay manondro fa na dia misy fahasamihafana mazava eo amin'ny tadivavarana misokatra sy mihidy aza, dia mitovy be ny tontolo manodidina ny BChls. Ny fiovan'ny mena absorption dia mety ho vokatry ny fihenan'ny fihetsehana mafana sy ny fitomboan'ny fahamarinan-toerana amin'ny tadivavarana mihidy (18, 19), ny fiovan'ny fifandraisan'ny pigment vokatry ny tadivavarana mihidy (20, 21), na ny fitambaran'ireo vokatra roa ireo (11).
(A) Spektrum absorption ultraviolet/hita maso/akaiky infrarouge, izay voamarika amin'ny pigments mifanaraka aminy ny tendrony ary naverina tamin'ny laoniny ho amin'ny tendrony BPh amin'ny 775 nm. (B) Spektrum dichroism boribory naverina tamin'ny laoniny ho amin'ny absorbance BChl amin'ny 805 nm. (C sy D) Spektra ΔA voafantina avy amin'ny spectra absorption resolved time-resolved an'ny complexe RC-LH114-W (C) sy complexe RC-LH116 (D). Ho an'ny fampitahana tsara kokoa, ny spectra rehetra dia naverina tamin'ny laoniny ho amin'ny ∆A an'ny −A amin'ny 0.2 ps. (E) Ny tahan'ny oxidation cytochrome c2 aorian'ny taratra eo anatrehan'ny fifantohana isan-karazany amin'ny UQ2 (jereo ny Sary S8 ho an'ny angon-drakitra manta). (F) Ao amin'ny sela ambolena eo ambanin'ny hazavana ambany, antonony na avo lenta (10, 30 na 300μMm-2 s-1, tsirairay avy), ny proteinina W sy ny subunits RC-L ao amin'ny complexe voadio sy ny tahan'ny membrane misaraka. Fantaro ny haavon'ny proteinina amin'ny alàlan'ny electrophoresis gel SDS-polyacrylamide sy immunoassay (jereo ny Sary S9 raha mila angon-drakitra manta). Fantaro ny tahan'ny fifandraisana amin'ny complexe RC-LH114-W voadio. Ny tahan'ny stoichiometrika an'ny RC-L amin'ny protein-W an'ny complexe dia 1:1.
Ny BChls eo amin'ny toerana 1 ao amin'ny tadivavarana αβ14 simba amin'ny RC-LH114-W (Sary 1, A, C, ary E) dia akaiky kokoa ny mpanome voalohany RC (P) amin'ny 6.8Å noho ny BChls mitovy amin'ny RC-LH116 (Sary 1, B, D, ary F, ary Sary S3); na izany aza, ny kinetika absorption transient an'ireo complexes roa dia mampiseho fa ho an'ny RC-LH114-W sy RC-LH116, ny fotoana famindrana angovo excitation tsy miovaova avy amin'ny LH1 mankany amin'ny RC dia 40 ±4 sy 44 ±3 ps (Sary 2). , C sy D, Sary S4 ary Tabilao S2). Tsy misy fahasamihafana manan-danja ihany koa amin'ny famindrana elektronika ao anatin'ny RC (Sary S5 sy lahatsoratra fanampiny mifandraika amin'izany). Miahiahy izahay fa ny fifandraisana akaiky eo amin'ny fotoana famindrana angovo eo amin'ny LH1 sy RC-P dia noho ny elanelana, ny zoro ary ny angovo mety ho an'ny ankamaroan'ny BChl ao amin'ny tadivavarana LH1 roa. Toa tsy haingana kokoa noho ny famindrana angovo mivantana avy amin'ny toerana tsy dia tsara indrindra mankany amin'ny RC ny fikarohana ny lamina angovon'ny LH1 mba hahatongavana amin'ny halavirana farany ambany indrindra. Ny tadivavarana LH1 misokatra ao amin'ny RC-LH114-W dia mety hiharan'ny fihetsehana mafana tsy dia misy dikany loatra amin'ny fepetra mari-pana ambany ho an'ny fanadihadiana ara-drafitra, ary misy endrika peratra αβ14 lava kokoa amin'ny mari-pana ao amin'ny efitrano avy amin'ny halavirana pigmentation an'ny βBChls eo amin'ny toerana misy ny RC 1.
Ny complexe RC-LH116 dia misy BChls 32 sy carotenoids 16, ary ny fandaminana azy amin'ny ankapobeny dia mitovy amin'ny azo avy amin'ny Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 strain (PDB ID 7C9R) (12) ary ahidrano maitso (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Taorian'ny fampifanarahana, dia nisy fiviliana kely teo amin'ny toerana misy ny αβ heterodimers ihany no hita, indrindra ny 1-5, 15, ary 16 (Sary S6). Ny fisian'ny protein-W dia misy fiantraikany lehibe amin'ny firafitry ny LH1. Ny TMH telo ao aminy dia mifandray amin'ny alalan'ny tadivavarana fohy, miaraka amin'ny N-terminal eo amin'ny ilany lumen amin'ny complexe ary ny C-terminal eo amin'ny ilany cytoplasmic (Sary 1A sy 3, A hatramin'ny D). Ny Protein-W dia tsy tia rano amin'ny ankapobeny (Sary 3B), ary ny TMH2 sy TMH3 dia mifandray amin'ny LH1αβ-14 mba hamorona velaran-tany transmembrane (Sary 3, B ary E hatramin'ny G). Ny interface dia ahitana indrindra ny sisa tavela Phe, Leu ary Val ao amin'ny faritra transmembrane. Ireo sisa tavela ireo dia misy asidra amine tsy tia rano sy pigment αβ-14. Ny sisa tavela polar sasany koa dia mandray anjara amin'ny fifandraisana, anisan'izany ny fifamatoran'ny hidrôzenina eo amin'ny W-Thr68 sy β-Trp42 eo amin'ny velaran'ny lavaka sarotra (Sary 3, F ary G). Eo amin'ny velaran'ny cytoplasm, ny Gln34 dia mifanila amin'ny vondrona keto an'ny carotenoids αβ-14. Ankoatra izany, ny molekiola n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) dia voavaha, ary ny rambony tsy tia rano dia mivelatra hatrany amin'ny interface eo amin'ny protein-W sy αβ-14, ary ny rambony lipida dia mety ho hita ao amin'ny vatana. Voamarikay ihany koa fa mifanakaiky be ny faritra misy ny C-terminal an'ny proteinina W sy RCH, saingy tsy ao anatin'ny sehatry ny fifandraisana manokana (Sary 1, A sy E). Na izany aza, mety hisy fifandraisana ao amin'ny asidra amine C-terminal tsy voavaha amin'ireo proteinina roa ireo, izay mety hanome mekanisma ho an'ny fandraisana ny proteinina-W mandritra ny fanangonana ny complexe RC-LH114-W.
(A) Ny Protein-W, izay miatrika ny fifandraisan'ny LH1αβ14 amin'ny endrika sariitatra, dia manana rojo sisiny miendrika tsorakazo (mena), aseho amin'ny ampahan'ny kisarisary mety ho elektrostatika (velarana volondavenona mangarahara miaraka amin'ny ambaratonga contour 0.13). (B) Ny Protein-W dia asehon'ny velarana miloko hydrophobic. Ny faritra polar sy misy fiampangana dia aseho amin'ny loko cyan, ny faritra hydrophobic dia aseho amin'ny loko fotsy, ary ny faritra hydrophobic tena mahery vaika dia aseho amin'ny loko volomboasary. (C sy D) Ny Protein-W aseho amin'ny sariitatra, ny fironany dia mitovy amin'ny ao amin'ny (A) (C), ary mihodina 180° (D). Araka ny toerana misy azy ao amin'ny filaharana, ny residues azo avahana dia mampiasa loko avana, izay manga ny N-terminal ary mena ny C-terminal. (E) Ny Protein-W amin'ny fijery mitovy amin'ny ao amin'ny (A), ary ny residues eo amin'ny fifandraisan'ny protein-W:LH1 dia asehon'ny tsorakazo misy marika mifamatotra. (F) Ahodina 90° ny Protein-W raha oharina amin'ny (E) sy LH1αβ14 amin'ny sary mihetsika, ary raha oharina amin'ny sisa tavela amin'ny interface amin'ny sary bara. Voasoratra anarana ireo sisa tavela mihantona avy amin'ny beta polypeptide. Aseho amin'ny endrika bara mifanandrify amin'ny lokon'ny Sary 1 ny cofactor, aseho amin'ny volondavenona ny β-DDM efa simba, ary aseho amin'ny mena ny oksizenina. (G) Ahodina 180° ny fijery ao amin'ny (F), miaraka amin'ireo sisa tavela miharihary amin'ny alpha polypeptide voamarika.
Misolo toerana ny αβ heterodimer (faha-15 ao amin'ny Sary 1F) ny Protein-W, ka misoroka ny fikatonan'ny tadivavarana sy ny fitongilanan'ny αβ heterodimer telo voalohany. Hita fa ny zoro fitongilanana ambony indrindra an'ny αβ-1 heterodimer voalohany raha oharina amin'ny sarimihetsika ara-dalàna dia 25° hatramin'ny 29° (Sary 1, A sy E), izay niforona tamin'ny fitongilanan'ny αβ-1 2° hatramin'ny 8° ao amin'ny RC A sharp contrast-LH116 (Sary 1, B sy F). Ny heterodimer faharoa sy fahatelo dia mitongilana amin'ny 12° hatramin'ny 22° sy 5° hatramin'ny 10° tsirairay avy. Noho ny sakana sterika an'ny RC, ny fitongilanan'ny αβ-1 dia tsy ahitana ny mpivady faharoa amin'ny αβ (izay mifanandrify amin'ny αβ faha-16 ao amin'ny Sary 1F), ka mamorona elanelana mazava ao amin'ny peratra LH1 (Sary 1, A sy E). Noho ny tsy fisian'ny heterodimer αβ roa, miaraka amin'ny fahaverezan'ny BChl efatra sy carotenoid roa, dia tsy misy amin'ireo carotenoid mifatotra amin'ny subunit αβ-1 miolikolika, ka miteraka peratra LH114-W misy carotenoid 13 Vegetarian sy BChl 28. Ny tombana eo an-toerana momba ny vahaolana eo an-toerana ho an'ireo complexes roa ao amin'ny faritra αβ1 hatramin'ny 7 dia ambany noho ny an'ny ambin'ny tadivavarana LH1, izay mety haneho ny plasticity inheren'ny subunit LH1 mifanila amin'ny toerana RC QB (Sary 4).
Aseho avy amin'ny fijery ambony/fijery avy amin'ny ilany (A sy B) (A sy C) ary ny velaran'ny lavaka mitovy amin'ny Sary 1. (B sy D) ny sarin'ny RC-LH114-W (A sy B) sy RC-LH116 (C sy D). Aseho eo ankavanana ny fanalahidy miloko.
Ny hany singa fototra mampiavaka azy hafa manana tahan'ny stoichiometrika 1:14 dia ny dimer Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Na izany aza, ny proteinina W sy PufX dia tsy manana homology miharihary, ary misy fiantraikany lehibe amin'ny rafitra LH1 tsirairay avy. PufX dia TMH tokana misy sehatra cytoplasmika N-terminal izay mifandray amin'ny lafiny cytoplasmika amin'ny subunit RC-H (13) amin'ny toerana mifanaraka amin'ny Rps. palustris LH116αβ-16. PufX dia mamorona fantsona ho an'ny fifanakalozana quinone/quinolone eo amin'ny RC-LH1 sy ny cytochrome bcl complex ary hita ao amin'ny Rba. sphaeroides core complex rehetra (13). Na dia ao amin'ny Rba aza ny interface monomer-monomer. Ny dimer sphaeroides RC-LH1-PufX dia hita eo amin'ny toerana ifamatoran'ny proteinina W ao amin'ny RC-LH114-W, ary ny elanelana ateraky ny PufX sy ny proteinina-W dia eo amin'ny toerana mitovy (Sary S7A). Ny elanelana ao amin'ny RC-LH114-W dia mifanaraka amin'ny fantsona quinone (8) an'ny Pseudomonas rosea LH1 ihany koa, izay foronin'ny peptides tsy mifandray amin'ny proteinina W na PufX (Sary S7B). Ankoatra izany, ny fantsona quinone ao amin'ny Blc. Ny LH1 maitso emeralda niforona tamin'ny fanesorana ny subunit γ iray (7) dia hita amin'ny toerana mitovy (Sary S7C). Na dia eo aza ny fisian'ny proteinina samihafa, ny fisehoan'ireo fantsona quinone/quinolol ireo amin'ny toerana iraisana ao amin'ny complexe RC-LH1 dia toa ohatra iray amin'ny fivoarana mifanindry, izay manondro fa ny elanelana noforonin'ny proteinina W dia mety hiasa ho fantsona quinone.
Ny elanelana eo amin'ny tadivavarana LH114-W dia mamela ny fiforonan'ny faritra membrane mitohy eo anelanelan'ny habaka anatiny amin'ny complexe RC-LH114-W sy ny membrane bulk (Sary 1G), fa tsy mampifandray ireo sehatra roa amin'ny alàlan'ny mason-proteinina toy ny amin'ny proteinina. Ny complexe RC-LH116 dia mitovy amin'ny complexe Tch mihidy. Mitovy amin'ny complexe Tch. Mitovy amin'ny fanjaitra (22) (Sary 1H) (Sary 1H). Koa satria haingana kokoa ny fiparitahan'ny quinone amin'ny alàlan'ny membrane noho ny fiparitahana amin'ny alàlan'ny fantsona proteinina tery, ny tadivavarana LH114-W misokatra dia afaka mamela ny fiovam-po RC haingana kokoa noho ny tadivavarana LH116 mihidy, ary mety ho voafetra kokoa ny fiparitahan'ny quinone ao amin'ny RC. Mba hitsapana raha misy fiantraikany amin'ny fiovan'ny quinone amin'ny alàlan'ny RC ny proteinina W, dia nanao fanadihadiana momba ny oksidasiona cytochrome tamin'ny fifantohana ubiquinone 2 (UQ2) (analog an'ny UQ10 voajanahary miaraka amin'ny rambony isoprene fohy kokoa) (Sary 2E). Na dia manakana ny famaritana marina ny tsy miovaovan'ny Michaelis aza ny fisian'ny quinone chelated (ny RC-LH114-W sy RC-LH116 dia mety amin'ny 0.2±0.1μM sy 0.5±0.2μM tsirairay avy), ny tahan'ny RC-LH114-W ambony indrindra (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) dia 28±5% lehibe kokoa noho ny RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Tombanana voalohany fa eo amin'ny 10% eo ho eo amin'ny fitambaran'ny fototarazo (16) ny proteinina-W; eto, ny tahan'ny fipetrahan'ny sela mitombo amin'ny hazavana ambany, hazavana antonony, ary hazavana avo dia 15±0.6%, 11±1% ary 0.9±0.5% tsirairay avy (Sary 2F). Ny fampitahana ny spektrometria amin'ny habetsahana dia naneho fa ny fanampiana ny marika histidine dia tsy nampihena ny habetsahan'ny proteinina-W raha oharina amin'ny karazana voajanahary (P = 0.59), ka tsy vokatry ny proteinina-W novaina ireo ambaratonga ireo (Sary S10). Na izany aza, ity fipetrahan'ny proteinina-W ambany ao amin'ny fitambaran'ny RC-LH1 ity dia mety hamela ny RC sasany hivadika haingana kokoa, ka mampihena ny fifanakalozana quinone/quinolone miadana kokoa ao amin'ny fitambaran'ny RC-LH116. Voamarikay fa ny tahan'ny fipetrahan'ny sela amin'ny hazavana avo dia tsy mifanaraka amin'ny angon-drakitra transcriptomics vao haingana, izay manondro fa mitombo ny fanehoana ny fototarazo pufW eo ambanin'ny hazavana mahery (Sary S11) (23). Mampisafotofoto ny fahasamihafana misy eo amin'ny fandikana pufW sy ny fampidirana proteinina-W ao amin'ny complexe RC-LH1 ary mety haneho ny fandrindrana sarotra ataon'ny proteinina.
Ao amin'ny RC-LH114-W, molekiola cardiolipin (CDL) 6, phosphatidylcholine (POPC) 7, phosphatidylglycerol (POPG) 1 ary β-DDM 29 no zaraina sy amboarina ao anatiny - CDL 6, POPC 24, POPG 2 ary βDDM 12. RC-LH116 (Sary 5, A sy B). Ao amin'ireo rafitra roa ireo, ny CDL dia saika hita eo amin'ny ilany cytoplasmika amin'ny complexe, raha ny POPC, POPG ary β-DDM kosa dia hita eo amin'ny ilany luminal. Molekiola lipida sy savony roa no navahana tao amin'ny faritra αβ-1 hatramin'ny αβ-6 amin'ny complexe RC-LH114-W (Sary 5A), ary dimy no navahana tao amin'ny faritra mitovy amin'ny RC-LH116 (Sary 5B). Nahitana lipida bebe kokoa teny amin'ny ilan'ny complexe, indrindra fa ny CDL, izay niangona teo anelanelan'ny RC sy αβ-7 ka hatramin'ny αβ-13 (Sary 5, A sy B). Ny lipida sy savony hafa voavaha ara-drafitra dia hita any ivelan'ny peratra LH1, ary ny rojo acyl voavaha tsara dia mivelatra eo anelanelan'ny subunits LH1, izay voatondro ho β-DDM ao amin'ny RC-LH114-W, ary faritana ho β-DDM ao amin'ny RC A fifangaroan'ny β-DDM sy POPC-LH116. Ny toerana mitovy amin'ny lipida chelating sy savony ao amin'ny rafitray dia manondro fa toerana mifamatotra ara-batana izy ireo (Sary S12A). Ny toerana misy ny molekiola mitovy amin'izany ao amin'ny Tch dia manana tsy fiovaovana tsara ihany koa. Gentle sy Trv. Ny karazana RC-LH1 970 (Sary S12, B hatramin'ny E) (9, 12) sy ny sisa tavela amin'ny fifamatoran'ny hidrôzenina amin'ny vondrona lohan'ny lipida dia naneho fiarovana tsara amin'ny fampifanarahana ny filaharana (Sary S13), izay manondro fa ny CDL voatahiry izay mifamatotra amin'ny RC (24), ireo toerana ireo dia mety ho voatahiry ao amin'ny complexe RC-LH1.
(A sy B) Asehon'ny sariitatra ny peptide RC-LH114-W (A) sy RC-LH116 (B), ary asehon'ny tsorakazo ny pigment, mampiasa ny loko ao amin'ny Sary 1. Aseho amin'ny loko mena ny lipida, ary aseho amin'ny loko volondavenona ny savony fanadiovana. Mavo ny UQ mifamatotra amin'ny toerana RC QA sy QB, raha manga kosa ny UQ mitokana. (C sy D) Mitovy amin'ny fijery (A) sy (B), tsy misy lipida. (E mankany G) Fijery lehibe kokoa ny Q1(E), Q2(F) ary Q3(G) avy amin'ny RC-LH116, miaraka amin'ny rojo sisiny izay mifampikasoka. Aseho amin'ny tsipika mainty misy teboka ny fatoran'ny hidrôzenina.
Ao amin'ny RC-LH116, samy potika ao amin'ny toerana fifamatorany ny RC QA sy QB UQ, izay mandray anjara amin'ny famindrana elektrôna amin'ny fizotran'ny fisarahana fiampangana. Na izany aza, ao amin'ny RC-LH114-W, ny QB quinone dia mbola tsy voavaha ary horesahina amin'ny antsipiriany etsy ambany. Ankoatra ny QA sy QB quinones, dia misy molekiola UQ roa misy chelate (hita eo anelanelan'ny peratra RC sy LH1) ao amin'ny rafitra RC-LH114-W araka ny vondrona lohany voavaha tsara (hita ao amin'ny Q1 sy Q2). habaka). Sary 5C). Singa isoprene roa no omena ny Q1, ary ny sarintany hakitroky dia mamaha ny rambony isoprene 10 feno an'ny Q2. Ao amin'ny rafitry ny RC-LH116, dia misy molekiola UQ10 misy chelate telo (Q1 hatramin'ny Q3, Sary 5D), ary ny molekiola rehetra dia manana hakitroky mazava manerana ny rambony (Sary 5, D hatramin'ny G). Ao amin'ireo rafitra roa ireo, ny toerana misy ny vondrona lohan'ny quinone an'ny Q1 sy Q2 dia manana fitoviana tsara (Sary S12F), ary mifandray amin'ny RC ihany izy ireo. Ny Q1 dia hita eo amin'ny fidirana amin'ny elanelana W an'ny RC-LH114-W (Sary 1G sy 5, C, D sy E), ary ny Q2 dia hita eo akaikin'ny toerana fifamatoran'ny QB (Sary 5, C, D) sy F). Ny residu L-Trp143 sy L-Trp269 voatahiry dia tena akaiky ny Q1 sy Q2 ary manome fifandraisana mety hitranga amin'ny π-stacking (Sary 5, E sy F, ary Sary S12). Ny L-Gln88, 3.0 Å avy amin'ny oksizenina distal an'ny Q1, dia manome fatorana hidrôzenina matanjaka (Sary 5E); ity residu ity dia voatahiry ao amin'ny RC rehetra afa-tsy ny fifandraisana lavitra indrindra (Sary S13). Soloina amin'ny fomba mahazatra ny Thr ao amin'ny ankamaroan'ny RC hafa ny L-Ser91 (Sary S13), 3.8 Angstroms avy amin'ny oksizenina metila ao amin'ny Q1, ary mety hanome fatorana hidrôzenina malemy (Sary 5E). Toa tsy manana fifandraisana manokana ny Q3, fa hita ao amin'ny faritra hydrophobic eo anelanelan'ny subunit RC-M sy ny subunit LH1-α 5 hatramin'ny 6 (Sary 5, D sy G). Ny Q1, Q2 ary Q3 na ireo quinones chelated akaiky dia hita ihany koa ao amin'ny Tch. Gentle, Trv. Strain 970 ary Blc. Ny firafitry ny iris (9, 10, 12) dia manondro toerana fifamatoran'ny quinone mpanampy voatahiry ao amin'ny complexe RC-LH1 (Sary S12G). Mifanaraka tsara amin'ny 5.8±0.7 amin'ny complexe tsirairay voafaritry ny high performance liquid chromatography (HPLC) ireo UQ dimy efa simba ao amin'ny RC-LH116, raha ambany noho ny an'ny UQ telo efa simba ao amin'ny RC-LH114-W kosa ny sanda voarefy 6.2±0.3 (Sary S14) dia manondro fa misy molekiola UQ tsy voavaha ao amin'ny rafitra.
Ny polypeptide L sy M pseudo-symmetric dia samy misy TMH dimy ary mamorona heterodimer izay mampifangaro dimer BChl iray, monomer BChl roa, monomer bacteriophage (BPh) roa, ary molekiola vy tsy Heme iray sy molekiola UQ10 iray na roa. Amin'ny alàlan'ny fisian'ny fatorana hidrôzenina eo amin'ny vondrona ketone terminal sy ny fanangonany fantatra amin'ny Rps, dia tafiditra ao amin'ny subunit M, izay antsoina hoe cis-3,4-dehydroorhodopin ny carotenoids. Karazana (25). Ny sehatra membrane ivelany an'ny RC-H dia mifamatotra amin'ny membrane amin'ny alàlan'ny TMH tokana. Ny rafitra RC amin'ny ankapobeny dia mitovy amin'ny subunit RC telo an'ny karazana mifandraika (toy ny Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Ny macrocycles an'ny BChl sy BPh, ny hazondamosina carotenoid ary ny vy tsy heme dia mifanindry ao anatin'ny elanelan'ny famaha ireo rafitra ireo, toy ny vondrona lohan'ny UQ10 eo amin'ny toerana QA sy ny quinone QB ao amin'ny RC-LH116 (Sary S15).
Ny fisian'ny rafitra RC roa miaraka amin'ny tahan'ny fibodoana toerana QB samihafa dia manome fahafahana vaovao handinihana ireo fiovana tsy tapaka miaraka amin'ny fifamatoran'ny QB quinone. Ao amin'ny complexe RC-LH116, ny QB quinone dia hita eo amin'ny toerana "proximal" mifamatotra tanteraka (26), saingy ny fisarahan'ny RC-LH114-W dia tsy manana QB quinone. Tsy misy QB quinone ao amin'ny RC-LH114-W, izay mahagaga satria mavitrika ny complexe, mihoatra noho ny complexe RC-LH116 miaraka amin'ny QB quinone voafaritra ara-drafitra. Na dia mifamatotra amin'ny quinones enina eo ho eo aza ny peratra LH1 roa, dimy no voafaritra ara-drafitra ao amin'ny peratra RC-LH116 mihidy, raha telo ihany no voafetra ara-drafitra ao amin'ny peratra RC-LH114-W misokatra. Ity fikorontanan'ny rafitra mitombo ity dia mety maneho ny fanoloana haingana kokoa ny toerana QB RC-LH114-W, ny kinetika quinone haingana kokoa ao amin'ny complexe, ary ny fitomboan'ny mety hiampitana ny tadivavarana LH1. Manoro hevitra izahay fa ny tsy fisian'ny UQ ao amin'ny toerana RC QB an'ny RC-LH114-W dia mety ho vokatry ny toerana sarotra sy mavitrika kokoa, ary ny toerana QB an'ny RC-LH114-W dia nijanona avy hatrany tao amin'ny fihodinan'ny UQ. Ny dingana manokana (nikatona ny fidirana amin'ny toerana QB) dia maneho ny endriky ny asa.
Raha tsy misy QB, dia miharihary ny fihodinan'ny L-Phe217 amin'ny toerana tsy mifanaraka amin'ny fifamatoran'ny UQ10, satria hiteraka fifandonana ara-habakabaka amin'ny singa isoprene voalohany amin'ny rambony izany (Sary 6A). Ankoatra izany, miharihary ireo fiovana lehibe miharihary amin'ny endriny, indrindra ny helix de (helix fohy eo amin'ny tadivavarana eo anelanelan'ny TMH D sy E) izay afindran'ny L-Phe217 mankany amin'ny paosin'ny fifamatoran'ny QB sy ny fihodinan'ny L-Tyr223 (Sary 6A) mba hanapahana ny fifamatoran'ny hidrôzenina amin'ny rafitra M-Asp45 ary hanidy ny fidirana amin'ny toerana fifamatoran'ny QB (Sary 6B). Mihodina eo amin'ny fotony ny helix de, mihetsika 0.33Å ny Cα an'ny L-Ser209, raha mihetsika 3.52Å kosa ny L-Val221Cα. Tsy misy fiovana hita maso amin'ny TMH D sy E, izay azo ampiarahina amin'ny rafitra roa (Sary 6A). Raha ny fantatsika, ity no rafitra voalohany ao amin'ny RC voajanahary izay manidy ny toerana QB. Ny fampitahana amin'ny rafitra feno (mifamatotra amin'ny QB) dia mampiseho fa alohan'ny hihena ny quinone, dia ilaina ny fanovana ny endriny mba hampidirana azy ao amin'ny quinone. Mihodina ny L-Phe217 mba hamorona fifandraisana π-stacking miaraka amin'ny vondrona lohan'ny quinone, ary mihetsika ivelany ny helix, mamela ny taolan'ny L-Gly222 sy ny rojo sisiny amin'ny L-Tyr223 hamorona tambajotra fatorana hidrôzenina miaraka amin'ny rafitra fatorana hidrôzenina marin-toerana (Sary 6, A sy C).
(A) Sary mihetsika mifanindry amin'ny hologram (rojo L, volomboasary/rojo M, magenta) sy apo (volondavenona), izay ahitana ireo singa fototra amin'ny endrika toy ny tsorakazo. Ny UQ10 dia aseho amin'ny bara mavo. Ny tsipika teboteboka dia manondro ny fatorana hidrôzenina miforona ao amin'ny rafitra manontolo. (B sy C) Ny fanehoana ny ety ambonin'ny apolipoprotein sy ny rafitra peratra manontolo, izay manasongadina ny oksizenina rojo sisiny amin'ny L-Phe217 amin'ny manga sy ny L-Tyr223 amin'ny mena. Volomboasary ny singa L; tsy miloko ny singa M sy H. (D sy E) Apolipoprotein (D) sy manontolo (E) toerana RC QB [lokoina amin'ny (A) tsirairay avy] ary Thermophilus thermophilus PSII (maitso, manga misy quinone plastika; PDB ID: 3WU2) Ampifanaraho (58).
Tsy nampoizina fa na dia misy aza ny rafitra maromaro amin'ny RC tsy ampy QB nefa tsy misy LH1, dia mbola tsy nisy tatitra teo aloha momba ny fiovana eo amin'ny endrika hita tamin'ity fandalinana ity. Anisan'izany ny rafitra fihenan'ny QB avy amin'ny Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) ary Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), izay saika mitovy amin'ny rafitra QB amin'ny ankapobeny. Ny fandinihana akaiky ny 3PRC dia naneho fa ny molekiola savony LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) dia mifamatotra eo amin'ny fidirana amin'ny toerana QB, izay mety hisoroka ny fandaminana indray ho endrika mihidy. Na dia tsy miharatsy amin'ny toerana mitovy aza ny LDAO ao amin'ny 1EYS na 1OGV, ireo RC ireo dia omanina amin'ny fampiasana savony mitovy ary noho izany dia mety hiteraka vokatra mitovy. Ny rafitra kristaly an'ny Rba. Toa manana toerana QB mihidy ihany koa ny Sphaeroides RC izay miara-kristalisasi amin'ny cytochrome c2 (PDB ID: 1L9B). Na izany aza, amin'ity tranga ity, ny faritra N-terminal amin'ny polypeptide RC-M (mifandray amin'ny toerana fifamatoran'ny QB amin'ny alàlan'ny fifamatorana H amin'ny residu Tyr eo amin'ny Q helix) dia mandray endrika tsy voajanahary, ary tsy nojerena bebe kokoa ny fiovan'ny endrika QB (30). Ny zavatra mampitony dia ny tsy nahitantsika ity karazana fiovaovan'ny polypeptide M ity tao amin'ny rafitra RC-LH114-W, izay saika mitovy amin'ny faritra N-terminal amin'ny RC-LH116 RC. Tsara homarihina ihany koa fa taorian'ny nanesorana ny antenne LH1 mifototra amin'ny savony, dia voavaha ny apolipoprotein RCs ao amin'ny PDB, izay nanafoana ny dobo quinone anatiny sy ny lipida tao amin'ny elanelana teo anelanelan'ny RC sy ny velaran'ny peratra LH1 manodidina (31, 32). Mbola miasa ny RC satria mitazona ny cofactors rehetra, afa-tsy ny QB quinone azo levona, izay tsy dia marin-toerana loatra ary matetika very mandritra ny dingana fanomanana (33). Ankoatra izany, fantatra fa ny fanesorana ny LH1 sy ny lipida cyclic voajanahary avy amin'ny RC dia mety hisy fiantraikany amin'ny fiasa, toy ny faharetan'ny androm-piainan'ny P+QB-state misaraka amin'ny fiampangana (31, 34, 35). Noho izany, dia mihevitra izahay fa ny fisian'ny peratra LH1 eo an-toerana manodidina ny RC dia mety hitazona ny toerana QB "mihidy", ka miaro ny tontolo iainana eo an-toerana akaikin'ny QB.
Na dia maneho sary roa fotsiny aza ny fiovan'ny toerana QB ny apolipoprotein (tsy misy QB quinone) sy ny rafitra feno, fa tsy andian-javatra maromaro, dia misy famantarana fa azo fehezina ny fifamatorana mba hisorohana ny fifamatorana indray amin'ny alalan'ny hydroquinone mba hanakanana ny fanakanana ny substrate. Mety ho samy hafa ny fifandraisan'ny quinolol sy quinone eo akaikin'ny toerana QB an'ny apolipoprotein, izay mitarika amin'ny fandavan'ny RC azy. Efa ela no naroso fa ny fiovan'ny endrika dia mitana anjara toerana amin'ny fifamatorana sy ny fampihenana ny quinones. Ny fahafahan'ny RC mangatsiaka mampihena ny quinones aorian'ny fampifanarahana amin'ny haizina dia voasakana (36); Ny kristalografia taratra X dia mampiseho fa io fahasimbana io dia vokatry ny QB quinones voafandrika ao anaty endrika "distal" eo amin'ny 4.5 Å miala amin'ny toerana proximal mavitrika (26), 37). Manoro hevitra izahay fa ity endrika fifamatorana distal ity dia sary an'ny toetry ny eo anelanelan'ny apolipoprotein sy ny rafitra peratra feno, izay manaraka ny fifandraisana voalohany amin'ny quinone sy ny fisokafan'ny toerana QB.
Ny RC karazana II hita ao amin'ny complexe PSII an'ny bakteria phototrophique sasany sy cyanobacteria, ahidrano ary zavamaniry dia manana fiarovana ara-drafitra sy ara-asa (38). Ny fampifanarahana ara-drafitra aseho amin'ny Sary 6 (D sy E) dia manantitrantitra ny fitoviana misy eo amin'ny PSII RCs sy ny toerana QB an'ny complexe RC bakteria. Ity fampitahana ity dia efa ela no modely ho an'ny fandalinana ireo rafitra mifandraika akaiky amin'ny fifamatorana sy ny fampihenana quinone. Ny boky navoaka teo aloha dia nanolo-kevitra fa ny fiovan'ny endrika dia miaraka amin'ny fihenan'ny quinone PSII (39, 40). Noho izany, raha jerena ny fiarovana evolisiona an'ny RC, ity mekanisma fifamatorana tsy hita teo aloha ity dia mety azo ampiharina amin'ny toerana QB an'ny PSII RC amin'ny zavamaniry phototrophique oksizenina ihany koa.
Ny Rps ΔpufW (famafana pufW tsy misy marika) sy ny PufW-His (proteinina-W misy marika C-terminal 10x His izay naseho avy amin'ny toerana pufW voajanahary). Ny palustris CGA009 dia voalaza tao amin'ny asanay teo aloha (16). Ireo karazana ireo sy ny ray aman-dreny karazana isogenic wild-type dia nalaina avy tao anaty vata fampangatsiahana tamin'ny alàlan'ny fanaparitahana sela vitsivitsy tamin'ny takelaka PYE (5 g isaky ny litatra -1) (voatahiry ao amin'ny LB amin'ny -80 °C, misy proteinina glycerol 50% (w/v), yeast extract ary succinate) agar [1.5% (w/v)]. Notehirizina nandritra ny alina tao anaty haizina tamin'ny mari-pana ao amin'ny efitrano tao anatin'ny toe-javatra anaerobic ny takelaka, ary avy eo nohazavaina tamin'ny hazavana fotsy (~50 μmolm-2 s-1) nomen'ny takamoa halogen OSRAM 116-W (RS Components, UK) nandritra ny 3 ka hatramin'ny 5 andro mandra-pipoiran'ny zanatany tokana. Zanatany tokana no nampiasaina mba hampidirana 10 ml ny akora M22+ (41) nasiana asidra casamino 0.1% (w/v) (antsoina hoe M22 eto). Novolena tao anaty haizina tamin'ny 34°C sady nohozongozonina tamin'ny 180 rpm nandritra ny 48 ora ny kolontsaina, ary avy eo dia nampidirina tao anaty toe-javatra mitovy nandritra ny 24 ora ny 70 ml tamin'ny kolontsaina. Ny kolontsaina semi-aerobic misy volume 1 ml dia ampiasaina hampidirana 30 ml ny akora M22 ao anaty tavoahangy fitaratra mangarahara 30 ml misy visy ary nohazavaina tamin'ny alalan'ny taratra (~50μmolm-2 s-1) nandritra ny 48 ora tamin'ny alalan'ny hery magnetika sterile. Avy eo dia nampidirina tao anaty kolontsaina 1 litatra eo ho eo ny 30 ml tamin'ny kolontsaina, izay nampiasaina avy eo hampidirana kolontsaina 9 litatra eo ho eo izay nohazavaina tamin'ny ~200 μmolm-2 s-1 nandritra ny 72 ora. Nojinjaina tamin'ny alalan'ny centrifugation tamin'ny 7132 RCF nandritra ny 30 minitra ireo sela, naverina natsipy tao anaty ~10 ml an'ny 20 mM tris-HCl (pH 8.0), ary notehirizina tamin'ny -20°C mandra-pahatongan'ny filàna azy.
Rehefa levona ny rano dia ampio kristaly deoxyribonuclease I (Merck, UK), lysozyme (Merck, UK) ary takelaka Roche holoenzyme protease inhibitor roa (Merck, UK) ao amin'ireo sela efa naverina natsipy. Tao anaty sela misy tsindry frantsay 20.000 psi (Aminco, Etazonia), dia nopotehina in-8 ka hatramin'ny in-12 ireo sela. Rehefa avy nesorina ireo sela tsy tapaka sy ireo poti-javatra tsy mety levona tamin'ny alalan'ny centrifugation tamin'ny 18.500 RCF nandritra ny 15 minitra tamin'ny 4°C, dia nalaina avy tao amin'ny lysate miloko tamin'ny alalan'ny centrifugation tamin'ny 113.000 RCF nandritra ny 2 ora tamin'ny 43.000°C ny fonon-javatra mety levona. Ariana ny ampahany mety levona ary avereno natsipy tao anaty 100 ka hatramin'ny 200 ml ny fonon-javatra miloko 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ary afangaro mandra-paha-tsy misy vongany hita maso intsony. Notehirizina tao anaty 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, Etazonia) misy 2% (w/v) β-DDM nandritra ny 1 ora tao anaty haizina tamin'ny 4°C sady afangaro moramora ny fonon-tavoahangy. Avy eo dia nosantrifizina tamin'ny 70°C mba handravahana 150.000 RCF amin'ny 4°C mandritra ny 1 ora mba hanesorana ireo zavatra tsy mety levona sisa tavela.
Ny fonon-drano mandevina avy amin'ny karazana ΔpufW dia nampiharina tamin'ny tsanganana fifanakalozana ion DEAE Sepharose 50 ml misy volume tsanganana telo (CV) misy buffer mifamatotra [20 mM tris-HCl (pH 8.0) misy 0.03% (w/v) β-DDM]. Sasao amin'ny buffer mifamatotra CV roa ny tsanganana, ary avy eo sasao amin'ny buffer mifamatotra roa misy 50 mM NaCl ny tsanganana. Ny complexe RC-LH116 dia nodiovina tamin'ny gradient linear 150 hatramin'ny 300 mM NaCl (ao amin'ny buffer mifamatotra) amin'ny 1.75 CV, ary ny complexe mifamatotra sisa dia nodiovina tamin'ny buffer mifamatotra misy 300 mM NaCl amin'ny 0.5 CV. Angony ny spektrum absorption eo anelanelan'ny 250 sy 1000 nm, tazomy ho mihoatra ny 1 ny ampahany manana tahan'ny absorbance (A880/A280) amin'ny 880 hatramin'ny 280 nm, afangaro indroa ao anaty buffer binding, ary ampiasao indray io fomba fiasa io amin'ny tsanganana DEAE amin'ny fanadiovana. Afangaro amin'ny tahan'ny A880/A280 mihoatra ny 1.7 ny ampahany ary mihoatra ny 3.0 ny tahan'ny A880/A805, ataovy ny fihodinana fahatelo amin'ny fifanakalozana ion, ary tazomy ny ampahany manana tahan'ny A880/A280 mihoatra ny 2.2 ary mihoatra ny 5.0 ny tahan'ny A880/A805. Nofantenana ho ~2 ml tao anaty sivana centrifugal Amicon 100.000 molekiolary weight cut-off (MWCO) (Merck, UK) ny complexe voadio ampahany, ary nampidirina tao anaty tsanganana exclusion Superdex 200 16/600 size (GE Healthcare, US) misy buffer NaCl 200 mM, ary avy eo dia nariana tao amin'io buffer io ihany tamin'ny 1.5 CV. Angony ny spectra absorption an'ny size exclusion fraction, ary ampifantohy amin'ny tahan'ny A880/A280 mihoatra ny 2.4 sy ny tahan'ny A880/A805 mihoatra ny 5.8 hatramin'ny 100 A880 ny spectra absorption, ary ampiasao avy hatrany izy ireo amin'ny fanomanana na fitahirizana cryo-TEM grid. Tehirizo amin'ny -80°C mandra-pilàna azy.
Ny fonon-drano mandevina avy amin'ny karazana PufW-His dia nampiharina tamin'ny tsanganana HisPrep FF Ni-NTA Sepharose 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8.0) misy 200 mM NaCl sy 0.03% (w/w)) ao amin'ny buffer IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM. Nosasana tamin'ny CV dimy amin'ny buffer IMAC ny tsanganana, ary avy eo tamin'ny CV dimy amin'ny buffer IMAC misy histidine 10 mM. Nesorina avy tao amin'ny tsanganana ny complexe core tamin'ny buffer IMAC dimy misy histidine 100 mM. Ny ampahany misy ny complexe RC-LH114-W dia afangaro amin'ny ~10 ml ao anaty tanky afangaro misy sivana Amicon 100,000 MWCO (Merck, UK), afangaro in-20 amin'ny buffer binding, ary avy eo ampiana amin'ny 25 ml. Ao amin'ny tsanganana DEAE Sepharose, CV efatra mifamatotra amin'ny buffer no ampiasaina mialoha. Sasao amin'ny "buffer" CV efatra ny tsanganana, dia esory ny "complex" amin'ny CV valo amin'ny gradient linear 0 hatramin'ny 100 mM NaCl (ao amin'ny "buffer" fifandraisana), ary ny CV efatra sisa misy "buffer" fifandraisana 100 mM. Ny "complex" sisa tavela izay nesorina tamin'ny klôro sodium miaraka amin'ny tahan'ny A880/A280 mihoatra ny 2.4 sy ny tahan'ny A880/A805 mihoatra ny 4.6 dia nofantenana ho ~2 ml tao anaty sivana centrifugal Amicon 100,000 MWCO, ary nofenoina IMAC 1.5 CV mialoha. Nohamafisin'ny Buffer ny tsanganana exclusion Superdex 200 16/600, ary avy eo nesorina tao amin'io buffer io ihany nandritra ny 1.5 CV. Angony ny spektra fidiran'ny singa tsy misy habe ary ampifantohy amin'ny tahan'ny A880/A280 mihoatra ny 2.1 sy ny tahan'ny A880/A805 mihoatra ny 4.6 hatramin'ny 100 - A880 ny spektra fidiran'ny singa, izay ampiasaina avy hatrany amin'ny fanomanana ny tambajotra TEM mangatsiaka na tehirizina amin'ny -80°C mandra-pilàna azy.
Nampiasaina hanomanana ireo harato TEM amin'ny mari-pana ambany ny vata fampangatsiahana Leica EM GP. Nohamainina tao anaty buffer IMAC ho 50 ny fitambaran-javatra, ary avy eo dia nampidirina tao anaty harato varahina QUANTIFOIL 1.2/1.3 vao nolokoina karbônina (Agar Scientific, UK) ny 5μl. Avela hilona amin'ny 20°C sy hamandoana 60% mandritra ny 30 segondra ny harato, avy eo dia kobanina maina mandritra ny 3 segondra, ary avy eo dia vonoina ao anaty etana ranoka amin'ny -176°C.
Noraketina tao amin'ny eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) ny angon-drakitra avy amin'ny complexe RC-LH114-W miaraka amin'ny mikroskopia Titan Krios, izay miasa amin'ny voltazy miakatra 300kV, miaraka amin'ny fampitomboana 130,000× ary angovo 20 eV. Nampiasaina ny Gatan 968 GIF Quantum miaraka amin'ny K2 peak detector mba handraisana sary amin'ny fomba fanisana mba hanangonana angon-drakitra. Ny haben'ny pixel voalamina dia 1.048Å, ary ny tahan'ny fatra dia 3.83 e-Å-2s-1. Nangonina tao anatin'ny 11 segondra ny sarimihetsika ary nozaraina ho faritra 40. Ampiasao ny faritra voarakotra karbônina mba hamerenana ny fifantohana amin'ny mikroskopia, ary avy eo angony sarimihetsika telo isaky ny lavaka. Amin'ny fitambarany, sarimihetsika 3130 no nangonina, miaraka amin'ny sandan'ny defocus eo anelanelan'ny -1 sy -3μm.
Nangonina tamin'ny alalan'io mikroskopy io ihany tao amin'ny Laboratoara Biostructure Asterbury (Oniversite Leeds, Royaume-Uni) ny angon-drakitra momba ny complexe RC-LH116. Nangonina tamin'ny fomba fanisana miaraka amin'ny fampitomboana 130 k ny angon-drakitra, ary nohavaozina ho 1.065 Å ny haben'ny pixel miaraka amin'ny fatra 4.6 e-Å-2s-1. Noraketina tao anatin'ny 12 segondra ny sarimihetsika ary nozaraina ho fizarana 48. Raha atambatra, sarimihetsika 3359 no nangonina, miaraka amin'ny sandan'ny defocus eo anelanelan'ny -1 sy -3μm.
Ny fanodinana angon-drakitra rehetra dia atao ao amin'ny fantsona Relion 3.0 (42). Ampiasao ny Motioncorr 2 (43) hanitsiana ny fihetsehan'ny taratra amin'ny alàlan'ny fandanjana fatra, ary avy eo ampiasao ny CTFFIND 4.1 (44) mba hamaritana ny masontsivana CTF (contrast transfer function). Ny sary mikrografy mahazatra aorian'ireo dingana fanodinana voalohany ireo dia aseho amin'ny Sary 2. S16. Ny môdely fisafidianana mandeha ho azy dia foronina amin'ny alàlan'ny fisafidianana tanana piksela 250 eo ho eo amin'ny poti-javatra 1000 ao anaty frame 250-piksel ary tsy misy fanasokajiana roa-dimensy (2D), ka mandà ireo fanasokajiana izay mahafeno ny fahalotoan'ny santionany na tsy manana toetra azo fantarina. Avy eo, dia natao ny fisafidianana mandeha ho azy tamin'ny mikrofotografia rehetra, ary ny RC-LH114-W dia poti-javatra 849,359, ary ny complexe RC-LH116 dia poti-javatra 476,547. Ireo singa voafantina rehetra dia nandalo dingana roa amin'ny fanasokajiana 2D tsy misy referansa, ary aorian'ny dingana tsirairay, ireo singa izay mifanena amin'ny velaran'ny karbônina, ny fahalotoan'ny santionany, ny tsy fisian'ny endri-javatra miharihary na ireo singa mifanindry mafy dia lavina, ka miteraka singa 772,033 (90.9%) sy 359,678 (75.5%). Ny modely referansa 3D voalohany dia novokarina tamin'ny fampiasana ny fomba fihenan'ny gradient stochastic. Amin'ny fampiasana ny modely voalohany ho referansa, ireo singa voafantina dia sokajiana ho sokajy efatra ao amin'ny 3D. Amin'ny fampiasana ny modely amin'ity sokajy ity ho referansa, dia manaova fanadiovana 3D amin'ireo singa ao amin'ny sokajy lehibe indrindra, avy eo ampiasao ny sivana ambany 15Å voalohany mba handrakofana ny velaran'ny solvent, ampio piksela 6 amin'ny sisiny malefaka, ary aorian'izay dia karakarao ireo piksela mba hanitsiana ny fiasan'ny famindrana Modulation Gatan K2 peak an'ny mpitsikilo ambony. Ho an'ny angon-drakitra RC-LH114-W, ity modely voalohany ity dia novaina tamin'ny fanesorana ny hakitroky matanjaka eo amin'ny sisin'ny saron-tava (tapaka amin'ny hakitroky ny complexe fototra ao amin'ny UCSF Chimera). Ny modely vokarina (ny famaha ny RC-LH114-W sy RC-LH116 dia 3.91 sy 4.16 Å, tsirairay avy) dia ampiasaina ho toy ny referansa ho an'ny fihodinana faharoa amin'ny fanasokajiana 3D. Ireo poti-javatra ampiasaina dia natambatra tao amin'ny kilasy 3D voalohany ary tsy misy fifandraisana matanjaka amin'ny manodidina. Fifanindriana na tsy fisian'ny endri-javatra ara-drafitra miharihary. Taorian'ny fihodinana faharoa amin'ny fanasokajiana 3D, ny sokajy manana famaha avo indrindra no nofidiana [Ho an'ny RC-LH114-W, ny sokajy iray dia poti-javatra 377,703 (44.5%), ho an'ny RC-LH116, misy sokajy roa, mitotaly poti-javatra 260,752 (54.7%), izay mitovy ihany rehefa ampifanarahina aorian'ny fihodinana voalohany miaraka amin'ny fahasamihafana kely]. Averina alaina ao anaty boaty 400-pixel ireo poti voafantina ary hatsaraina amin'ny alalan'ny fanadiovana 3D. Ny saron-tava solvent dia foronina amin'ny alalan'ny sivana ambany 15Å voalohany, fanitarana sarintany 3 pixel ary saron-tava malefaka 3 pixel. Amin'ny alalan'ny fanadiovana CTF isaky ny poti, fanitsiana ny fihetsehan'ny poti ary ny fihodinana faharoa amin'ny fanadiovana CTF isaky ny poti, fanatsarana 3D, fanaronana solvent ary fanodinana aorian'ny dingana tsirairay dia tanterahina aorian'ny dingana tsirairay mba hanatsarana bebe kokoa ny endrika vokarina. Amin'ny fampiasana ny sandan'ny fanapahana FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) 0.143, ny famaha ny modely farany amin'ny RC-LH114-W sy RC-LH116 dia 2.65 sy 2.80Å. Ny fiolahana FSC amin'ny modely farany dia aseho amin'ny Sary 2. S17.
Avy amin'ny UniProtKB avokoa ny filaharan'ny proteinina rehetra: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). Nampiasaina hanamboarana modely homolojian'ny RC ny SWISS-MODEL (45), izay ahitana ny filaharan'ny proteinina an'ny RC-L, RC-M ary RC-H ary ny rafitra kristaly an'ny Rba. Nampiasaina ho modely ny sphaeroides RC (PDB ID: 5LSE) (46). Ampiasao ny fitaovana "fit map" ao amin'ny UCSF Chimera mba hampifanarahana ny modely novokarina amin'ny sarintany (47), hatsarao ny firafitry ny proteinina, ary ampiasao ny Coot (48) hanampiana ny cofactor [4×BChl a (anarana residue monomer library = BCL), 2×BPh a (BPH), karazana UQ10 iray na roa (U10), vy tsy heme iray (Fe) ary 3,4-dihydrohexacarbonylcholine (QAK) iray]. Koa satria tsy misy ao amin'ny tranomboky monomer ny QAK, dia nohamarinina tamin'ny fampiasana ny fitaovana eLBOW ao amin'ny PHENIX (49) izany.
Manaraka izany, dia naorina ny singa LH1. Tamin'ny voalohany, ny fitaovana fanorenana mandeha ho azy ao amin'ny PHENIX (49) dia nampiasaina hanamboarana ho azy ny ampahany amin'ny filaharan'ny LH1 amin'ny fampiasana ny sarintany sy ny filaharan'ny proteinina LH1-α sy LH1-β ho toy ny fampidirana. Safidio ny singa LH1 feno indrindra, esory izany ary ampidiro ao amin'ny Coot, ampio amin'ny tanana ny filaharana tsy ampy ao anatiny, ary hatsarao amin'ny tanana ny rafitra manontolo alohan'ny hanampiana BCl roa (BCL) sy spirilloxanthin (CRT) [araka ny Rps mifandraika amin'izany Ny hakitroky ny complexe LH1 sy ny votoatin'ny carotenoid fantatra. Karazana (17)]. Adikao ny singa LH1 feno, ary ampiasao ny UCSF Chimera "Docking Map Tool" mba hampidirana ao amin'ny faritra tsy modely mifanila amin'ny hakitroky ny LH1, ary avy eo hatsarao ao amin'ny Coot; avereno ny dingana mandra-pahavita ny modely ny singa LH1 rehetra. Ho an'ny rafitra RC-LH114-W, amin'ny alàlan'ny fanesorana ny hakitroky tsy voazara ao amin'ny Coot, ny proteinina dia zaraina amin'ireo singa tsy proteinina sisa ao amin'ny sarintany USCF Chimera ary ny fitaovana Autobuild no ampiasaina hametrahana ny modely voalohany, ary ny modely ireo singa sisa (protein-W). Ao amin'ny PHENIX (49). Ampio izay filaharana tsy hita amin'ny modely vokarina ao amin'ny Coot (48), ary avy eo dia hatsarao amin'ny tanana ny singa iray manontolo. Ny hakitroky tsy voazara sisa dia mifanaraka amin'ny fitambaran'ny lipida (PDB monomer library ID an'ny CDL = CDL, POPC = 6PL ary POPG = PGT), β-DDM detergent (LMT) ary molekiola UQ10 (U10). Ampiasao ny fanatsarana PHENIX (49) sy ny fanatsarana amin'ny tanana ao amin'ny Coot (48) mba hanatsarana ny modely voalohany feno mandra-pahatongan'ny statistika modely sy ny kalitaon'ny fahitana ny fitoviana tsy azo hatsaraina bebe kokoa. Farany, ampiasao ny LocScale (50) mba hanatsarana ny sarintany eo an-toerana, ary avy eo dia manaova tsingerina maromaro hafa amin'ny modely ny hakitroky tsy voazara sy ny fanatsarana mandeha ho azy sy amin'ny tanana.
Aseho ao amin'ny Sary 1 sy 2. S18 hatramin'ny S23 ny peptides, cofactors ary lipids sy quinones hafa mifamatotra ao anatin'ny hakitroky ny tsirairay avy. Aseho ao amin'ny Tabilao S1 ny fampahalalana statistika momba ny modely farany.
Raha tsy misy voalaza manokana, dia nangonina tamin'ny spektrofotometatra Cary60 (Agilent, Etazonia) ny spektra fidiran'ny taratra UV/Vis/NIR tamin'ny elanelam-potoana 1 nm manomboka amin'ny 250 nm ka hatramin'ny 1000 nm ary tao anatin'ny fotoana fampidirana 0.1s.
Afangaro ao anaty cuvette quartz misy lalana 2 mm mankany amin'ny A880 1 ny santionany, ary angony ny spectrum absorption eo anelanelan'ny 400 sy 1000 nm. Nangonina tamin'ny spectropolarimeter Jasco 810 (Jasco, Japon) tamin'ny elanelam-potoana 1 nm eo anelanelan'ny 400 nm sy 950 nm amin'ny tahan'ny scan 20 nm min-1.
Ny coefficient molar extinction dia faritana amin'ny alàlan'ny fanalefahana ny complexe core ho A880 eo amin'ny 50 eo ho eo. Afangaro amin'ny buffer binding na methanol 990μl ny volume 10μl, ary angony avy hatrany ny spectrum absorption mba hampihenana ny fahasimban'ny BChl. Ny votoatin'ny BChl amin'ny santionany methanol tsirairay dia nokajiana tamin'ny coefficient extinction amin'ny 771 nm amin'ny 54.8 mM-1 cm-1, ary voafaritra ny coefficient extinction (51). Zarao amin'ny 32 (RC-LH114-W) na 36 (RC-LH116) ny fifantohana BChl voarefy mba hamaritana ny fifantohana complexe core, izay ampiasaina avy eo hamaritana ny spectrum absorption an'ny santionany mitovy nangonina tao amin'ny buffer Extinction coefficient. mifanitsy. Nalaina intelo ny fandrefesana isaky ny santionany, ary ny salan'isa absorbance an'ny BChl Qy ambony indrindra no nampiasaina tamin'ny kajy. Ny koefisian'ny fandringanana ny RC-LH114-W refesina amin'ny 878 nm dia 3280±140 mM-1 cm-1, raha toa kosa ny koefisian'ny fandringanana ny RC-LH116 refesina amin'ny 880 nm dia 3800±30 mM-1 cm-1.
Norefesina araka ny fomba ao amin'ny (52) ny UQ10. Raha fintinina, ny HPLC dingana mivadika (RP-HPLC) dia natao tamin'ny fampiasana ny rafitra Agilent 1200 HPLC. Arotsaho ao anaty 50μl methanol:chloroform 50:50 misy klôro ferrika 0.02% (w/v) ny RC-LH116 na RC-LH114-W, ary ampidiro ao anaty 1 ml-1 min-1 amin'ny 40°C ao anaty solvent HPLC (80:20 methanol:2-propanol) eo amin'ny tsanganana ×25 cm ny RC-LH116 na RC-LH114-W eo amin'ny 0.02 nmol eo ho eo, ary ampidiro ao anaty 1 ml-1 min-1 amin'ny 40°C ao anaty solvent HPLC (80:20 methanol:2-propanol) ny Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm efa voalanjalanja. Arotsaho ao anaty solvent HPLC 1 ml-1 amin'ny 40°C ao anaty solvent HPLC (80:20 methanol:2-propanol) eo amin'ny tsanganana ×25 cm. Manaova elution isocratic ao anaty solvent HPLC mba hanaraha-maso ny absorbance amin'ny 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoids) ary 780 nm (BChl) mandritra ny 1 ora. Nampidirina ny tampon'isa tao amin'ny chromatogram 275 nm tamin'ny 25.5 minitra, izay tsy nahitana akora hafa azo tsikaritra. Ny faritra nampidirina dia ampiasaina hikajiana ny habetsaky ny molar an'ny UQ10 nalaina miaraka amin'ny fiolahana fanamarinana kajy avy amin'ny fampidirana fenitra madio manomboka amin'ny 0 ka hatramin'ny 5.8 nmol (Sary S14). Nohadihadiana tamin'ny famerenana telo ny santionany tsirairay, ary ny hadisoana voalaza dia mifanaraka amin'ny SD an'ny salan'isa.
Vahaolana misy ny complexe RC-LH1 miaraka amin'ny absorption Qy ambony indrindra 0.1 no nomanina tamin'ny cytochrome c2 fo soavaly voahena 30 μM (Merck, UK) sy 0 hatramin'ny 50 μMUQ2 (Merck, UK). Santionany 1-ml telo no nomanina tamin'ny fifantohana UQ2 tsirairay ary notehirizina nandritra ny alina tao anaty haizina tamin'ny 4°C mba hahazoana antoka fa mifanaraka tanteraka amin'ny haizina alohan'ny fandrefesana. Napetraka tao anaty spectrophotometer modular OLIS RSM1000 misy harato lelafo 300 nm/500, fidirana 1.24 mm, afovoany 0.12 mm ary fivoahana 0.6 mm ny vahaolana. Napetraka eo amin'ny fidirana amin'ny phototube santionany sy ny fantsona photomultiplier reference ny sivana mandalo 600 nm mba hanesorana ny hazavana excitation. Nojerena tamin'ny 550 nm ny absorbance niaraka tamin'ny fotoana fampidirana 0.15 s. Avoaka avy amin'ny LED M880F2 880 nm (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) amin'ny alalan'ny tariby fibre optique amin'ny hamafin'ny 90% amin'ny alalan'ny mpanara-maso DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) ny hazavana mampientanentana ary avoaka mankany amin'ny loharanon-jiro amin'ny zoro 90°. Mifanohitra amin'ny fitaratra ny taratra fandrefesana mba hamerenana izay hazavana tsy voarain'ny santionany voalohany. Araho maso ny absorbance 10 s alohan'ny hazavana 50 s. Avy eo dia arahi-maso bebe kokoa mandritra ny 60 s ao anaty haizina ny absorbance mba hanombanana ny habetsaky ny quinolol mampihena ho azy ny cytochrome c23+ (jereo ny Sary S8 ho an'ny angon-drakitra manta).
Nokarakaraina ny angon-drakitra tamin'ny alàlan'ny fampifanarahana ny tahan'ny fanombohana lineary ao anatin'ny 0.5 ka hatramin'ny 10 s (miankina amin'ny fifantohana UQ2) ary ny salan'isa ny tahan'ny santionany telo amin'ny fifantohana UQ2 tsirairay. Ny fifantohana RC-LH1 izay nokajiana tamin'ny coefficient extinction tsirairay avy dia nampiasaina mba hanovana ny tahan'ny ho fahombiazana catalytic, naseho tao amin'ny Origin Pro 2019 (OriginLab, Etazonia), ary nampifanarahana tamin'ny modely Michaelis-Menten mba hamaritana ny sandan'ny Km sy Kcat miharihary.
Ho an'ny fandrefesana ny fidiran'ny taratra mihelina, ny santionany RC-LH1 dia natsonika ho ~2μM tao anaty buffer IMAC misy 50 mM sodium ascorbate (Merck, Etazonia) sy 0.4 mM Terbutin (Merck, Etazonia). Ny asidra ascorbic dia ampiasaina ho mpamatsy elektrôna sorona, ary ny tert-butaclofen dia ampiasaina ho toy ny inhibitor QB mba hahazoana antoka fa ny mpamatsy RC lehibe dia mijanona ho mihena (izany hoe, tsy photooxidized) mandritra ny dingana fandrefesana. Eo amin'ny 3 ml eo ho eo ny santionany no ampiana amin'ny sela mihodina manokana (eo amin'ny 0.1 m eo ho eo ny savaivony, 350 RPM) miaraka amin'ny halavan'ny lalana optika 2 mm mba hahazoana antoka fa ny santionany ao amin'ny lalan'ny laser dia manana fotoana ampy hampifanarahana ny haizina eo anelanelan'ny pulses excitation. Ampiasao ny pulses laser ~100-fs mba hanamafisana ny rafitra laser Ti: Sapphire (Spectra Physics, Etazonia) mba hampientanentana ny santionany amin'ny 880 nm amin'ny tahan'ny famerimberenana 1 kHz (20 nJ ho an'ny NIR na 100 nJ ho an'ny Vis). Alohan'ny hanangonana angon-drakitra, dia ataovy eo ambanin'ny hazavana mampientanentana mandritra ny 30 minitra eo ho eo ny santionany. Ny fiparitahana dia hiteraka ny tsy fiasan'ny QA (mety hampihena ny QA indray mandeha na indroa). Mariho anefa fa azo averina io dingana io satria rehefa avy nanova ny haizina nandritra ny fotoana maharitra, dia hiverina tsikelikely amin'ny fiasan'ny QA ny RC. Nampiasaina handrefesana ny spectra mihelina miaraka amin'ny fotoana fahatarana -10 hatramin'ny 7000 ps ny spectrometer Helios (Ultrafast Systems, Etazonia). Ampiasao ny rindrambaiko Surface Xplorer (Ultrafast Systems, Etazonia) mba hanasarahana ireo angon-drakitra, avy eo dia ampiarahina sy ampifanarahina. Ampiasao ny fonosana rindrambaiko CarpetView (Light Conversion Ltd., Litoania) mba hampiasana ny angon-drakitra mitambatra mba hahazoana spectra samihafa mifandraika amin'ny fahasimbana, na ampiasao ny fiasa izay mampivondrona exponents maromaro miaraka amin'ny valintenin'ny fitaovana mba hifanaraka amin'ny fivoaran'ny spectral misy halavan'ny onjam-peo tokana ao amin'ny Origin (OriginLab, Etazonia).
Araka ny voalaza etsy ambony (53), dia nomanina ny sarimihetsika photosynthetic misy LH1 complex tsy misy RC sy peripheral LH2 antenne. Nohavaozina tao anaty 20 mM tris (pH 8.0) ny membrane ary avy eo nampidirina tao anaty quartz cuvette misy lalana optika 2 mm. Nampiasaina ny laser 30nJ mba hampientanentana ny santionany amin'ny 540 nm miaraka amin'ny fotoana fahatarana -10 hatramin'ny 7000 ps. Alaharo araka ny voalaza ho an'ny santionany Rps. pal ny angon-drakitra.
Nopotehina tamin'ny alalan'ny centrifugation tamin'ny 150.000 RCF nandritra ny 2 ora tamin'ny 4°C ny fonon-damba, ary avy eo dia naverina natsonika tao anaty 20 mM tris-HCl (pH 8.0) sy 200 mM NaCl ny fidirany tamin'ny 880 nm. Afangaro moramora ao anaty haizina amin'ny 4°C ny β-DDM 2% (w/v) mandritra ny 1 ora. Natsonika tao anaty 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) ny santionany ka nahatratra fifantohana proteinina 2.5 mg ml-1 (fanadihadiana Bio-Rad). Nisy fanodinana fanampiny natao avy amin'ny fomba navoaka teo aloha (54), nanomboka tamin'ny fanatsorana ny proteinina 50 μg ho lasa TEAB 50 μl misy sodium laurate 1% (w/v) (Merck, UK). Rehefa avy nohavaozina nandritra ny 60 segondra, dia nahena tamin'ny 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (Merck, UK) tamin'ny 37°C nandritra ny 30 minitra. Ho an'ny S-alkylation, dia atsobohy amin'ny 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) ny santionany ary ampio avy amin'ny vahaolana isopropanol 200 mM mandritra ny 10 minitra amin'ny mari-pana ao an-trano. Natao tamin'ny fanampiana fangaro trypsin/endoproteinase Lys-C 2 μg (Promega UK) ny fandevonan-kanina proteolytika ary nohavaozina tamin'ny 37°C nandritra ny 3 ora. Nalaina ny surfactant laurate tamin'ny fanampiana 50 μl ethyl acetate sy 10 μl 10% (v/v) LC grade trifluoroacetic acid (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) ary novokisana nandritra ny 60 segondra. Nohamafisina tamin'ny centrifugation tamin'ny 15,700 RCF nandritra ny 5 minitra ny fisarahana dingana. Araka ny protocole-n'ny mpanamboatra, dia nampiasaina ny tsanganana mihodina C18 (Thermo Fisher Scientific, UK) mba hanesorana sy hanesorana tsara ny sira amin'ny dingana ambany misy ny peptide. Rehefa avy nohamainina tamin'ny alalan'ny centrifugation banga, dia nolevonina tao anaty TFA 0.5% sy acetonitrile 3% ny santionany, ary nohadihadiana tamin'ny alalan'ny nanoflow RP chromatography miaraka amin'ny spectrometry mass ny 500 ng tamin'ny fampiasana ny masontsivana rafitra voalaza teo aloha.
Ampiasao ny MaxQuant v.1.5.3.30 (56) ho an'ny famantarana sy fandrefesana ny proteinina mba hikarohana ny tahiry proteome Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Ny angon-drakitra proteomics momba ny spectrometry mass dia napetraka ao amin'ny ProteomeXchange Alliance amin'ny alàlan'ny tahiry mpiara-miasa PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) eo ambanin'ny famantarana angon-drakitra PXD020402.
Ho an'ny fanadihadiana amin'ny alalan'ny RPLC miaraka amin'ny electrospray ionization mass spectrometry, ny complex RC-LH1 dia nomanina avy amin'ny Rps karazana wild. Amin'ny fampiasana ny fomba efa navoaka teo aloha (16), ny fifantohana proteinina vokarina ao amin'ny sela palustris dia 2 mg ml-1 ao anatin'ny 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl ary 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad analysis)) DDM. Araka ny protocole-n'ny mpanamboatra, ampiasao ny kitapo fanadiovana 2D (GE Healthcare, Etazonia) mba hanesorana proteinina 10 μg amin'ny alalan'ny fomba precipitation, ary levona ao anaty 20 μl 60% (v/v) asidra formika (FA), 20% (v/v) Acetonitrile ary 20% (v/v) rano ny precipitate. Dimy microliters no nodinihina tamin'ny alalan'ny RPLC (Dionex RSLC) miaraka amin'ny mass spectrometry (Maxis UHR-TOF, Bruker). Ampiasao ny tsanganana MabPac 1.2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) ho an'ny fisarahana amin'ny 60°C sy 100μlmin -1, miaraka amin'ny gradient 85% (v / v) solvent A [0.1% (v / v) FA sy 0.02% (V/v) TFA solution aqueous] amin'ny 85% (v/v) solvent B [0.1% (v/v) FA sy 0.02% (v/v) ao anaty 90% (v/v) acetonitrile TFA]. Amin'ny fampiasana ny loharanon'ny ionisation electrospray mahazatra sy ny masontsivana mahazatra mandritra ny 60 minitra mahery, ny spectrometer mass dia mahazo 100 hatramin'ny 2750 m/z (tahan'ny mass-to-charge). Noho ny fanampian'ny fitaovana FindPept portal resource exPASy bioinformatics (https://web.expasy.org/findpept/), dia ampifandraiso amin'ny sarintany ny spectrum mass amin'ny subunits an'ny complexe.
Nobeazina nandritra ny 72 ora teo ambanin'ny hazavana NF-ambany 100 ml (10μMm-2 s-1), antonony (30μMm-2 s-1) na avo lenta (300μMm-2 s-1) ireo sela. M22 antonony (M22 antonony izay tsy ampiasaina ny ammonium sulfate ary soloina sodium acetate ny sodium succinate) tao anaty tavoahangy misy visy 100 ml (23). Tao anatin'ny tsingerina dimy 30 segondra, dia nopotehina tamin'ny tahan'ny volume 1:1 ny vakana fitaratra 0.1 micron mba handravahana ireo sela ary nangatsiaka tamin'ny ranomandry nandritra ny 5 minitra. Nesorina tamin'ny alalan'ny centrifugation tamin'ny 16,000 RCF nandritra ny 10 minitra tao anaty microcentrifuge teo ambony latabatra ireo zavatra tsy mety levona, ireo sela tsy vaky ary ireo vakana fitaratra. Nosarahina tao anaty rotor Ti 70.1 niaraka tamin'ny RCF 100,000 tao anaty tris-HCl 20 mM (pH 8.0) miaraka amin'ny gradient sucrose 40/15% (w/w) nandritra ny 10 ora ny fonon'ny sela.
Araka ny voalaza tao amin'ny asanay teo aloha, ny fitiliana ny mari-pamantarana His amin'ny PufW (16). Raha fintinina, ny complexe core voadio (11.8 nM) na ny membrane misy ny fifantohana RC mitovy (voafaritra amin'ny alàlan'ny oxidation manala ny spectrum difference mihena ary mampifanaraka ny enta-mavesatra amin'ny gel voaloko) ao amin'ny buffer loading SDS 2x (Merck, UK) dia natsonika indroa. Nosarahina tamin'ny gel NuPage 12% bis-tris replica (Thermo Fisher Scientific, UK) ireo proteinina. Nolokoina tamin'ny Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) ny gel iray mba hampidirana sy hijerena ny subunit RC-L. Ny proteinina amin'ny gel faharoa dia nafindra tany amin'ny membrane polyvinylidene fluoride (PVDF) methanol-activated (Thermo Fisher Scientific, UK) ho an'ny immunoassay. Nosakanana tao anaty vovo-dronono 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) Tween-20 ary 5% (w/v) ronono tsy matavy ny fonon'ny PVDF, ary avy eo dia notehirizina niaraka tamin'ny antibody voalohany anti-His (Afangaro amin'ny 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, Etazonia) nandritra ny 4 ora. Rehefa avy nosasana in-3 nandritra ny 5 minitra tao anaty "antibody buffer", dia natambatra tamin'ny "horseradish peroxidase" (Sigma-Aldrich, UK) "antibody faharoa" anti-totozy (natsonika 1:10,000 tao anaty "antibody buffer") ny fonon'ny sela mba hahafahana mamantatra azy (5 minitra aorian'ny fanasana in-3 tao anaty "antibody buffer") amin'ny fampiasana ny WESTAR ETA C 2.0 chemiluminescence substrate (Cyanagen, Italia) sy Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Amin'ny alalan'ny fanaovana ny fizarana ny hamafin'ny gel voaloko tsirairay na ny lalan'ny immunoassay, ny fampidirana ny faritra eo ambanin'ny tendrony ary ny fikajiana ny tahan'ny hamafin'ny RC-L (gel voaloko) sy ny Protein-W (immunoassay), ao amin'ny ImageJ (57) Process ny sary. Ireo tahan'ny ireo dia novaina ho tahan'ny molar amin'ny fiheverana fa ny tahan'ny RC-L amin'ny proteinina-W ao amin'ny santionany RC-LH114-W madio dia 1:1 ary ny fanitsiana ny angon-drakitra manontolo araka izany.
Raha mila fitaovana fanampiny ho an'ity lahatsoratra ity dia jereo ny http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Lahatsoratra azon'ny rehetra idirana ity, zaraina araka ny fepetran'ny Lisansa Creative Commons Attribution. Ity lahatsoratra ity dia mamela ny fampiasana, fizarana ary famokarana tsy misy fetra amin'ny fitaovana rehetra raha toa ka voatonona araka ny tokony ho izy ny asa tany am-boalohany.
Fanamarihana: Ny adiresy mailakao ihany no angatahinay aminao mba hahafantaran'ilay olona atolotrao ny pejy fa tianao ho hitany ilay mailaka ary tsy spam izany. Tsy haka adiresy mailaka izahay.
Ity fanontaniana ity dia ampiasaina hitsapana raha mpitsidika ianao ary hisorohana ny fandefasana spam mandeha ho azy.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Ny rafitra avo lenta amin'ny complexe light trap 1 ao amin'ny foibem-pihetsehana dia manome fahatakarana vaovao momba ny dinamikan'ny quinone.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Ny rafitra avo lenta amin'ny complexe light trap 1 ao amin'ny foibem-pihetsehana dia manome fahatakarana vaovao momba ny dinamikan'ny quinone.
©2021 American Association for the Advancement of Science. Zo rehetra voatokana. Ny AAAS dia mpiara-miasa amin'ny HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ary COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.